1、1第十篇 商品试剂和设备第三章 深部真菌感染的实验室诊断第一节： 1-3-D-葡聚糖测定1、1-3-D-葡聚糖测定（G 试验）浊度法及显色法检测原理分别是什么？答：浊度法检测原理:1,3-D-葡聚糖能特异性激活鲎试剂中的 G 因子，活化的 G 因子使凝固酶原转变成凝固酶，凝固酶作用在凝固蛋白原上，通过酶切的作用，产生凝固蛋白，发生凝固反应，从而引起检测溶液透光率变化，根据检测被测溶液透光率变化对真菌 1,3-D-葡聚糖浓度进行定量。显色法检测原理：1,3-D-葡聚糖能特异性激活鲎试剂中的 G 因子，活化的 G 因子使凝固酶原转变成凝固酶，凝固酶作用在显色底物上，通过酶切的作用，将寡肽和显色基团
2、（PNA）分离，显色基团的量和 1,3-D-葡聚糖的量呈正比，根据检测其溶液吸光度变化对真菌 1,3-D-葡聚糖浓度进行定量。2、G 试验显色法检测较浊度法有哪些优势？答：（1）有效的排除干扰，特异性明显提高；（2）显色基质使其灵敏度大为提高；（3）适用于血清标本的检测。3、为什么同一份标本在不同实验室检测结果不一致？答：这与检测系统有关。目前 G 试验没有行业标准，只有企业标准。而不同厂家设计生产的检测系统（包括试剂和仪器）的性能不同，这里涉及到使用的标准品、试剂来源等 ，故检测结果不具有可比性。4、G 试验结果提示病人有真菌感染，而真菌培养结果为阴性，如何解释？答：这主要与培养法和非培养法
3、检测的原理不同和对疾病诊断的窗口期不同有关。真菌进入人体后，会在较短的时间内释放出 1,3-D-葡聚糖，因此，在感染早期就可能呈现阳性结果。而培养则需要细菌在体内有一定的增殖过程，2因此在感染的高峰期培养阳性率高。有文献报告血浆 1,3-D-葡聚糖在侵袭性真菌感染症状出现前 5 天就可呈检出。方法学上讲，内毒素和 1,3-D-葡聚糖检查多采用鲎试验方法，具有简便、快速、定量的特点，而培养则需要时间，细菌和真菌的体外生长需要一定的条件，如果条件（例如培养基、温度、时间等） 如掌握不好，则难于培养成功。根据文献报告，对侵袭性真菌感染的诊断，血浆 1,3-D-葡聚糖的诊断特异度和敏感度均高于培养，其
4、 ROC 曲线下面积（AUC）也大于培养方法。5、血培养阳性，G 实验为什么是阴性？答: （1）病人存在吞噬细胞功能缺陷，如粒细胞缺乏症等，真菌进入血液但是没有被吞噬细胞处理，1,3-D-葡聚糖没有释放出来，或释放的很少，故G 试验阴性。 （2）进入血液内的真菌数量很少，1,3-D-葡聚糖释放的很少，没有达到 G 试验检测最低限。 （3）使用了抑制 1,3-D-葡聚糖释放的抗真菌药物，如棘白菌素类等。6、病人甲的临床表现比病人乙的轻，可病人甲的检测值比病人乙的检测值高？答：这里有几方面的问题。第一，病人免疫功能有差异。真菌进入人体后，需要在吞噬细胞作用下，才能将细胞壁上的 1,3-D-葡聚糖释
5、放到血液或其他体液中，被检测出来。如果病人吞噬细胞功能减低，真菌不能被吞噬破坏，细胞壁上的 1,3-D-葡聚糖不能释放出来，也就无法检测出来。这时病人病情可能更为严重。第二，疾病的不同阶段，1,3-D-葡聚糖水平是有变化的。一般来说，随着抗真菌药物的治疗，感染的控制，1,3-D- 葡聚糖水平也会相应下降。因此，如果两个病人处于疾病的不同阶段，其检测结果是不可比较的。此外，不同的真菌 1,3-D-葡聚糖水平也不同。如念珠菌感染者血清 1,3-D-葡聚糖平均值为 755 p g/ mL ，曲霉感染者 1,3-D-葡聚糖平均值为 1 103 pg/ mL ，镰刀霉感染者 1,3-D-葡聚糖平均值为
6、1 652 pg/ mL ，接合菌（毛霉、根霉） 细胞壁不产 1,3-D-葡聚糖，感染接合菌的患者血清 1,3-D-葡聚糖值为 0 ，隐球菌细胞壁外有荚膜包裹，因此不易检测到细胞壁上的抗原，但是在一定条件下荚膜自身可释放出极微量的 1,3-D-葡聚糖到血清中，所以检测值3可大于 0，但仍小于阳性判断标准。而对于口腔和其他器官的真菌定植患者，1,3-D-葡聚糖值也较低，一般不超过 20 pg/ mL（或者其他检测热体系的阳性诊断值） 。7、G 试验为什么要强调连续检测？答：1,3-D- 葡聚糖水平是随着疾病过程而变化的。因此，在感染的最早期，细菌或真菌刚刚进入人体，数量较少，因此检测不出来。或者
7、由于病人机体免疫功能的变化，1,3-D- 葡聚糖的产生速度和量也有变化，或者由于某些干扰因素存在造成假阳性或假阴性结果。因此，不能只靠一次检测结果就判定有无感染，我国许多侵袭性真菌感染诊断标准中都要求次检测结果均大于诊断值才有诊断意义。此外，检测应覆盖整个疾病过程，特别是在疾病早期更应重视连续检测，以免出现漏诊或误诊。8、为什么 G 试验的重复性不理想？答：1,3-D- 葡聚糖自身一些理化性质就可以影响 G 试验。反应易受葡聚糖的分子量、分支度，特别受到三维结构的影响。发现平均分子量在 6.8-216.0kDa 之间的 1,3-D-葡聚糖，随其分子量增加和分支度减少，激活 G 因子的能力越强；
8、分子量在 6.75-27.50 kDa 之间的 1,3-D-葡聚糖的裂褶菌多糖对G 因子的级联反应有抑制作用。Aketagawa 等发现单股螺旋的 1,3-D-葡聚糖在G 因子反应中起着决定性作用；Nagi 等在研究试验条件时发现三股螺旋的 1,3-D-葡聚糖不与 G 因子反应。故该法测定之前常用 NaOH 对 1,3-D-葡聚糖进行预处理，使其转化为单股螺旋的 1,3-D-葡聚糖，已减少实验误差。会不会真菌释放的 1,3-D-葡聚糖发生上述变化，尚不清楚。不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是接近失效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用接近失效期鲎试剂的时候，应对
9、灵敏度进行复核，以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。9、哪些抗菌药物对 G 试验有正干扰现象？答：文献报告磺胺类、阿莫西林/克拉维酸、头孢类药物药物可造成假阳性。4头孢菌素类中可能涉及头孢哌酮钠、头孢美唑钠、头孢米诺、头孢西丁、头孢噻肟钠、头孢噻肟和头孢哌酮/舒巴坦钠。此外厄他培南也可能造成假阳性，具体机制尚不清楚。哌拉西林/他唑巴坦尚不清楚有无干扰，但对半乳甘露聚糖（GM）试验有正干扰。10、患者使用可引起假阳性的血液制品，含真菌成分的抗肿瘤药物或者透析治疗及手术后多长时间检查 G 试验可避免假阳性？答：血液制品中白蛋白和免疫球蛋白可激活 G 因子途径，对 G 试验影响很大。文献报告，静脉输入 I
10、gG 10g 可使血浆浓度升高达 300pg/mL 以上，这足以误诊为侵袭性真菌感染（IFI） 。血浆的平均半衰期为 20（3.1-181.3）h ，推断在 1 周后复查 1,3-D-葡聚糖浓度应明显下降或转阴，可作为与 IFI 的鉴别。这与上述物质的代谢有关，抗菌素一般 48 小时后上述物质代谢完成或排出体外，但是血浆制品，包括白蛋白代谢半衰期较长，一般需要停用 10 天左右再查合适。11、某些细菌的败血症也可引起 G 试验出现假阳性，能具体说明吗 ?答：文献报告某些细菌败血病患者，例如链球菌败血症，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的一些可溶性抗原可造成 G 试验假阳性。败血症患者，特别合并全
11、身炎症反应综合征的病人，由于机体内产生许多炎症因子，如 IL-6 和IL-8，这些炎症因子可参与试验过程，引起假阳性结果。文献报道，在重症监护病房住院时间超过 14 天的患者多伴有不同程度血浆1,3-D-葡聚糖浓度升高，而这些患者并不一定为 IFI；某些细菌感染，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌感染以及凝固酶阴性的葡萄球菌脓毒症时可能出现 G试验假阳性结果。甚至部分支原体、EB 病毒感染患儿 G 试验亦呈阳性，但多为轻度升高，且 7 天后复查多已转阴性，考虑可能与感染本身。 12、抗真菌药物对 G 试验检测结果有什麽影响？答：抗真菌药物治疗后真菌生长受到抑制，这是明确的。但是由于药物作5用机理不同
12、，对 G 试验结果不完全一致。例如，两性霉素 B 脂质体能够作用于真菌细胞壁成分甘露聚糖和甘露聚糖蛋白质复合体使之结构不稳定以致胞壁破坏，可能造成 1,3-D-葡聚糖值一过性增高 。而卡泊芬静为葡聚糖合成酶抑制剂，非竞争性地抑制真菌细胞壁的 1,3-D-葡聚糖的合成，可以造成假阴性结果。13、G 试验质控时，直接使用厂家提供的均值和标准差是否合适？答：不能。这是因为厂家和用户使用的试验条件不同。厂家提供的质控品的定值不能作为质控中的均值，必须按照质控规范在自己的检测系统和试验条件下重新测定。标准差也是如此。14、为什么质控品必须和试剂同一批号？答：这是 G 试验的一个特点。因为每批生产的试剂敏
13、感度不同，取决于每批试剂中主试剂（鲎血中 G 因子）活性。活性不同， 1,3-D-葡聚糖对它的反应结果不同。而质控数据是建立在具体反应体系上的，不同批号间的质控数据是有差异的。15、标准曲线能不能代替质控品？答：可以，不过每天都要做标准曲线，以确保当天检测结果正确可靠。但是，要特别提醒用户，不能使用公司提供的标准曲线，一定要用户自己做标曲。16、为什么质控数据在控，而病人的测定结果仍有问题？答：这要看用户在建立最初质控数据时是否先做了标准曲线（也就是定标） 。如果用户没有定标就进行 20 个质控数据的测定，那些数据很可能不正确。无论是标准曲线，还是质控数据，还是病人样本的检测都与试剂有关。试剂
14、有变化，其他结果也会随之变化。所以，试剂更换批号，标准曲线和质控数据都要重新建立。617、当日一批试验结果中出现数个结果与临床诊断不符合，如何解决？答：（1）观察当日质控结果是否失控？（2）检查操作过程有无差错？（3）检查试剂有无过期或变质？是否使用不同批号的试剂？（4）检查标准曲线是否合格？（5）了解病人采样时的临床背景，如病程、是否使用抗真菌药物治疗等。（6）找厂家工程师检查。18、有没有真菌 1,3-D-葡聚糖检测的免疫学方法?答:-半乳糖神经酰胺可高亲和地与 1,3-D-葡聚糖结合。Donald 等依次建立一种以 -半乳糖神经酰胺包被物，鼠抗 1,3-D-葡聚糖单克隆抗体的酶联免疫吸附
15、检测系统，特异性检测生物体液中 1,3-D-葡聚糖。发现 1,3-D-葡聚糖含量低于 0.8ng/mL 时线性良好，并具有良好的回收率，相对于鲎试验受干扰物质影响更小，同样具有较高的精密度和准确度。但本法尚无分子量、分支度及三维构型对检测结果影响的报告。此外，鼠抗 1,3-D-葡聚糖单克隆抗体是否能广谱识别各种真菌 1,3-D-葡聚糖还需要进一步验证。第二节：念珠菌抗原和抗体测定一、念珠菌抗原测定1. 可用于检测的念珠菌病相关抗原有哪些？答：念珠菌病相关的血清学检测主要通过检测患者血液循环中的各类抗原：如甘露聚糖（mannan） 、1-3-D 葡聚糖、细胞质烯醇化酶（Eno） 、磷酸甘油酸酯激
16、酶（Pgk1p ） 、热休克蛋白 (HSP90)以及蛋氨酸合酶（ Met6p ）等。其中，甘露聚糖是目前研究最为广泛的一种真菌血清抗原。2. 为什么甘露聚糖可用于侵袭性念珠菌病的检测？7答：甘露糖是目前研究最为广泛的一种真菌血清抗原,它对热稳定,广泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要组成成分,甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不变的,常常受周围环境的营养状态和细胞形态的影响。其在真菌致病过程中参与了免疫调节、防御，而且抗甘露糖抗体具有保护性作用。酵母菌中导致侵袭性感染者主要为念珠菌属，少数为新生隐球菌，当念珠菌感染时，甘露聚糖会被释放入血，故可进行血液检测。而隐球菌的厚荚膜使细胞壁上的甘露
17、聚糖难以释放人血而不易测得，所以血浆中甘露聚糖抗原阳性与侵袭性念珠菌感染有高度相关性，可用于早期诊断侵袭性念珠菌感染。3. 为什么检测甘露聚糖可用于侵袭性念珠菌病早期诊断？答：念珠菌免疫学检测技术在灵敏度和特异性方面都较组织病理学、念珠菌培养、直接镜检和影像学检查有明显的优势，抗原检测阳性要早于念珠菌培养阳性，敏感性达 80%以上，正逐渐成为念珠菌检测的常用方法。在国内外侵袭性真菌感染的诊断标准中，均认为血清念珠菌抗原阳性可作为微生物学诊断标准，因此测定血清中的甘露聚糖有助于侵袭性念珠菌病的早期诊断、早期治疗。4. 目前，念珠菌病相关抗原检测有商品化的试剂吗？答：以上提到的甘露聚糖（manna
18、n） 、1-3-D 葡聚糖、细胞质烯醇化酶（Eno） 、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p） 、热休克蛋白(HSP90)以及蛋氨酸合酶（Met6p ）等念珠菌相关抗原中，只有 1-3-D 葡聚糖（G 试验）和甘露聚糖检测有商品化试剂提供，其它相关抗原目前仅限于科研。5. 商品化的念珠菌甘露聚糖抗原检测试剂盒有哪些？答：目前，商品化的念珠菌甘露聚糖抗原检测试剂盒极少，国外产品只有伯乐（Bio-Rad）公司生产的 PLATELIA Candida 试剂盒；国内产品只有天津贻诺琦（Bio-Enoche）生物工程有限公司（中美合资）生产的念珠菌甘露聚糖抗原检测试剂盒。86. 念珠菌甘露聚糖检测试剂盒原理？答
19、：伯乐（Bio-Rad）公司 Platelia Candida 试剂盒原理：该试剂盒采用双抗体夹心一步法，待检血清（或血浆）中的甘露聚糖或标准品与包被在酶标板上的鼠单抗（捕获抗体）及辣根过氧化物酶标记的鼠单抗（检测抗体）形成抗体-抗原 -抗体复合物，再加入底物显色，在酶标仪 450nm 处测定吸光度值，测定值和待检抗原的浓度呈正相关，根据甘露聚糖标准品绘制标准曲线并计算待检标本中甘露聚糖的浓度（pg/ml） 。该试剂盒可进行定性或定量分析。贻诺琦（Bio-Enoche）公司试剂盒原理：该试剂盒采用竞争法， 先将甘露聚糖包被在酶标板上，再加入待检血清（或血浆）和辣根过氧化物酶标记的甘露聚糖抗体，
20、此时，待检标本中的甘露聚糖及甘露聚糖标准品与酶标板上的甘露聚糖竞争性结合有限的抗体结合位点，再加入底物显色，在酶标仪 450nm 处测定吸光度值，测定值和待检抗原的浓度呈负相关，可根据甘露聚糖标准品绘制标准曲线并计算待检标本中甘露聚糖的浓度（pg/ml） 。该试剂盒可进行定性或定量分析。7. 念珠菌甘露聚糖检测试剂盒可检测什么标本？答：可检测血清或血浆标本。8. 待检标本为什么需要预处理？答：血清或血浆标本均需要预处理。标本与处理液混合后加热，可以：（1）将标本中的抗原-抗体复合物解离，有利于抗原检测。（2）将标本中的蛋白质变性并沉淀，减少其对免疫测定的干扰。9. 标本如何进行预处理？9答：在
21、离心管中加 300L 待检血清或血浆，再加入 100L 样本处理液，漩涡震荡 10 秒混匀，将离心管放入水浴锅内 100加热 90 秒后 10000g 离心 10分钟，取上清即可进行检测。10. 如何保证甘露聚糖试剂盒检测的可靠性？答：为保证实验的准确性、可靠性和减少系统误差，每次实验都必须做标准曲线和质控品，并在标准曲线 r0.98 以上和质控品不失控的前提下才能进行数据分析。11. 开展甘露聚糖检测需用什么仪器设备？答：需要使用的仪器包括：酶标仪（450nm） 、恒温箱（ 37） 、离心机、水浴锅、混旋器等。二、念珠菌抗体测定1. 念珠菌抗体检测有什么临床意义？答：过去人们并不看好真菌抗体
22、检测在诊断中的作用，但是近年来的研究表明，抗体检测在以下方面具有重要临床意义：（1）区分真菌感染与定植。（2）免疫缺陷的患者仍可以产生达到诊断水平的抗体浓度。（3）真菌感染有一个相对较长的潜伏期，抗体的检测能满足临床对诊断时间窗的要求。（4）抗原和抗体联合检测可提高临床诊断的敏感性和特异性。2. 为什么检测抗体可以区分念珠菌感染与定植？答：定植者抗体水平很低，而感染者抗体水平明显增高，完全可以通过临10界值加以区分。特别是选择那些只有在侵袭性感染时才释放出来的优势抗原，就可以避免定植所引起的假阳性。Fasahat F Alam 等分别对 32 例念珠菌培养阳性患者、51 例临床疑似念珠菌感染患
23、者、10 例念珠菌定植者和 16 例健康人进行念珠菌甘露聚糖抗体检测，结果显示念珠菌培养阳性和临床疑似念珠菌感染者抗体阳性率和抗体效价均较高，而念珠菌定植者抗体阳性率和抗体效价均较低，健康人抗体均阴性。该研究提示，可以建立适当的抗体临界值将念珠菌感染和定植加以区分。3. 免疫缺陷的患者能检测到念珠菌抗体吗？答：抗体产生依赖于正常的免疫机能，而 IFI 患者多处于免疫缺陷状态，无法正常产生抗体，或产生迟缓。2006 年 Pitarch 等将白念珠菌细胞壁成分用二维电泳技术分离，进行免疫蛋白质组学研究，用侵袭性念珠菌病人血清和对照血清分别与之反应，筛选出与患者血清发生强烈反应的免疫优势抗原。这些抗
24、原主要有: 烯醇化酶（ Eno） 、磷酸甘油酸酯激酶（Pgk1p ） 、蛋氨酸合酶（ Met6p ） 、-1，3 葡萄糖基转移酶（ Bgl2p）和果糖二磷酸醛缩酶（ Fba1） 。IC 患者可能产生针对这些抗原的抗体，甚至是严重的免疫抑制患者如肝移植、干细胞移植和 HIV 患者也可产生这些抗体。 4. 念珠菌抗体检测适用于侵袭性念珠菌病早期诊断吗？答：Yera 等的研究表明，有 73%的侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）患者至少可以早于血培养阳性结果 2 天检出抗体，最多可早于15 天，平均为 7 天。 近年来的研究显示: 念珠菌在黏膜定植时可能已有部分细胞壁抗原暴露于宿主免疫系统。当发生 IC 时，机体产生免疫记忆反应，表现出相对早期 IgG 的反应，并优于 IgM。而 IgM 升高的血清抗体其抗原是念珠菌胞浆内抗原，在定植共生状态下，可能极少暴露于机体体液免疫系统。当发生IC 时，免疫受损患者表现出与免疫正常患者类似的血清学反应，IgG 早期升高，说明血清抗体检测同样也适用于免疫受损患者早期诊断念珠菌病。并且随着抗
