1、1凯氏定氮法测奶粉中真实蛋白质的含量摘 要实验用凯氏定氮法测定奶粉中的蛋白质含量，将硫酸及催化剂与奶粉一同加热消化，使蛋白质分解，其中 C、H 形成 CO2、H 2O 逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。关键词: 凯氏定氮法 蛋白质 消化 蒸馏1 前言：劣质奶粉的出现严重地损害了人民群众的健康,劣质奶粉的主要特点是蛋白质含量远低于正常值。正是利用氮与蛋白质含量间的关系，实验室测定蛋白质的非直接性，一些不法人士钻了蛋白质中氮的含量。他们
2、利用三聚氰胺含有很高的氮，将三聚氰胺残掺杂近奶粉中以提高奶粉的蛋白质含量。而长期饮用这些蛋白质含量极低的奶粉，首先会导致婴儿严重营养不良，随后会引起各种并发症，在外来细菌的侵袭之下，婴儿几乎完全丧失了自身的免疫能力，病情发展十分迅速，最后婴儿头部严重水肿，几乎看不清五官，全身皮肤也出现了大面积的高度溃烂，伤口长时间无法愈合，最后导致呼吸衰竭而死亡。因此，测定奶粉中蛋白质含量，对掌握其营养价值和品质的变化，保障人体的健康，合理配料，为乳制品深加工提供数据十分重要，此外，蛋白质分解产物对乳制品的色、香、味都有一定的作用，所以测定具有深远意义。2 实验目的（1） 学习凯氏定氮法的测定蛋白质的原理；（
3、2） 掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量的计算等。3 实验原理各种天然有机物的含氮量通常用微量凯氏定氮法（micro-Kjeldahl method）来测定。当有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸铵。消化产生2的硫酸铵在蒸馏过程中与强碱（40%氢氧化钠）反应，放出氨。氨被带指示剂的硼酸吸收后，用标准盐酸溶液滴定。根据标准盐酸的消耗量可以计算样品的总氮量。反应式如下：消化： 含氮有机物+H 2SO4CO 2+H2O+NH32NH3+H2SO4（NH4） 2SO4蒸馏： （NH 4） 2SO4+2NaOHH 2O+2NH3+ Na2SO4
4、2NH3+4HBO3（带指示剂）（NH 4） 2B4O7+5 H2O酒红色 鲜绿色滴定： （NH 4） 2B4O7+2HCL+5 H2O 2 NH4CL+4H3BO4鲜绿色 淡紫色消化过程时间较长，为加速反应，在消化时常加入硫酸钾与硫酸铜混合粉末来促进。期中硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾，可以提高溶液的沸点（一般纯硫酸的沸点在340左右，而添加硫酸钾后可是温度提高到 400以上） ，提高反应温度，从而加快有机物的分解。硫酸铜起催化作用。在凯式定氮中可用的催化剂的种类很多，出硫酸铜外，还有氧化汞、硒粉、二氧化钛等，但综合价格、效果及环境污染等因素，硫酸铜的应用最为广泛。微量凯氏定氮法蒸馏样品时每次
5、适合 0.21.0 mg 的氮含量。4.实验设备凯氏烧瓶、移液管、酸式滴定管、电炉、容量瓶、凯氏定氮蒸馏装置5 实验材料和试剂材料 奶粉一包试剂 浓硫酸（AR） ；硫酸钾-硫酸铜混合物（K 2SO4 ：CuSO 4 5H2O=3:1 、6:1 或10:1） ；40%氢氧化钠溶液；2%硼酸溶液；0.01 mol/L 标准盐酸（要标定） ；甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5 份 0.2%溴甲酚绿溶液（含 95%乙醇）与一份 0.2%甲基红乙醇溶液混合；2% 硼酸指示剂混合液（2%硼酸溶液 100mL，加混合指示剂 1mL） 。6 操作步骤6.1 消化称取 0.10.5g 样品于 50mL 干燥的凯氏烧
6、瓶内，加入硫酸钾-硫酸铜混合粉末30.30.5g，再加入浓硫酸 5mL。用消化炉加热，在通风橱中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火力保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。另取凯氏烧瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。将凯氏烧瓶中的待测样品及空白消化液冷却后，分别转入 100mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，备用。6.2 蒸馏按下图所示安装微量凯氏定氮装置。将微量凯氏定氮蒸馏仪洗涤，先用自来水清洗，再用蒸汽蒸洗至流出液不能使带指示剂的
7、硼酸明显变色。关闭电源，放空蒸馏瓶中的热水，待蒸馏瓶冷至室温后加样品蒸馏。取一只三角瓶，加入硼酸-知识剂混合液 10mL,置于冷凝管端口下，为防止蒸出的氨气逃逸至空气中，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。吸取稀释消化液210mL（控制每个蒸馏样品的含氮量在 0.21.0mg 内） ，置于蒸馏装置的反应室中，加入 40%氢氧化钠溶液 10mL，将进样夹夹紧，再在漏斗中加一些蒸馏水，作为水封，检查各夹子是否有漏水漏气现象，确保不漏时，开冷却水，开始进行样品的蒸馏。加热蒸气发生器，沸腾后，三角瓶中的硼酸-指示剂混合液接收蒸馏出的氨，当出馏液使硼酸由酒红色变为鲜绿色时开始计时，继续蒸馏 5
8、10min 后，让硼酸液面离开冷凝管端口，再蒸馏 12 分钟后，再用少许蒸馏水冲洗冷凝管口。移开硼酸吸收瓶，关闭电源，清洗蒸馏器，准备下一个样品的蒸馏。空白样品的蒸馏按同样操作进行。6.3 滴定样品和空白均蒸馏完毕后，用 0.01moL/L 标准盐酸滴定，至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点，记录消耗标准盐酸溶液的体积数（mL） 。41.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶7 结果和计算7.1 数据记录项 目 第一次 第二次 第三次样品消化液（mL）滴定消耗盐酸标准溶液（mL）消耗盐酸标准溶液平
9、均值（mL）7.2 结果计算样品中的含氮量（%）=（V 2-V1）c14N100/(1000m)样品中的粗蛋白含量（%）=（V 2-V1）c146.25N 100/(1000m)其中，V 2：滴定样品消耗的标准盐酸溶液的体积（ mL） ；V1：滴定样品消耗的标准盐酸溶液的体积（mL） ；c：标准盐酸溶液的浓度（mol/L） ；m：样品的质量（g） ；14：氮原子的相对摩尔质量；6.25：蛋白质与氮的换算系数；N：消化样品的稀释倍数N= 消化液定容的体积（mL）/ 蒸馏时所取消化液（mL）的体积。8 注意事项5（ 1） 样 品 应 是 均 匀 的 。 固 体 样 品 应 预 先 研 细 混 匀
10、， 液 体 样 品 应 振 摇 或 搅 拌 均 匀 。 （ 2） 样 品 放 入 定 氮 瓶 内 时 ， 不 要 沾 附 颈 上 。 万 一 沾 附 可 用 少 量 水 冲 下 ， 以 免 被 检 样消 化 不 完 全 ， 结 果 偏 低 。 （ 3） 硝 化 时 如 不 容 易 呈 透 明 溶 液 ， 可 将 定 氮 瓶 放 冷 后 ， 慢 慢 加 入 30%过 氧 化 氢 2-3ml， 促 使 氧 化 。 （ 4） 在 整 个 消 化 过 程 中 ， 不 要 用 强 火 。 保 持 和 缓 的 沸 腾 ， 使 火 力 集 中 在 凯 氏 瓶 底 部 ，强 火 加 热 易 产 生 大 量 泡 沫 与 烟 雾 ， 导 致 蛋 白 质 附 在 烧 瓶 壁 或 冷 凝 管 壁 上 ， 在 接 触 不到 硫 酸 的 情 况 下 ， 消 化 不 完 全 会 使 测 定 结 果 偏 小 。（ 5） 氨 是 否 完 全 蒸 馏 出 来 ， 可 用 PH 试 纸 试 馏 出 液 是 否 为 碱 性 。 参 考 文 献1北京大学化学系分析化学教研室编.基础分析化学实验.北京大学出版社. 1993.52厦门大学化学系(无机与分析).基础化学实验一.科学出版社.2001.83曾富华等.生物化学实验技术教程.高等教育出版社.2011.7
