1、中国组织工程研究 第 18 卷 第 2 期 20140108 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 8, 2014 Vol.18, No.2ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 231www.CRTER.org曾建军，男，1977 年生，湖南省怀化市人，汉 族，中南大学湘雅医学院毕业，讲师，主要从事神经发 育方面的研究。通讯作者：潘爱华，博士，教授，中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系，湖南省长沙市 410013 doi:10.3969/j.issn.2095-434
2、4.2014.02.012 http:/www.crter.org中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2014)02-00231-08稿件接受：2013-11-08Zeng Jian-jun, Lecturer, Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China; Department of Human Anatomy, Huaihua Medical
3、College, Huaihua 418000, Hunan Province, ChinaCorresponding author: Pan Ai-hua, M.D., Professor, Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, ChinaAccepted: 2013-11-08电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化曾建军 1, 2，贺 旭 1，严小新
4、 1，罗学港 1，潘爱华 1 (1中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系，湖南省长沙市 410013；2湖南怀化医学高等专科学校人体解剖学教研室，湖南省 怀化市 418000)文章亮点：1 单侧嗅觉剥夺模型是体内神经元活性/代谢抑制/降低的经典模型之一，文章创新点在于通过电烙铁损伤左侧外周鼻孔区建立嗅觉功能剥夺模型，在接近于生理学状态的条件下进行体内实验。2 研究发现嗅觉功能活动与神经发生密切相关，文章采用单侧嗅觉剥夺模型来揭示嗅觉功能活动在神经发生和转化中的作用，通过检测微管聚合蛋白、维生素 D 依赖性钙结合蛋白和小白蛋白在嗅球的表达情况和形态，以揭示单侧嗅觉剥夺的可能机制。3 文章的不
5、足之处在于虽然发现神经元功能活动能影响神经发生和转化，但其作用的分子机制仍没有阐述。关键词：组织构建；组织工程；单侧嗅觉剥夺；嗅球；微管聚合蛋白；维生素 D 依赖性钙结合蛋白；小白蛋白；国家自然科学基金主题词：嗅觉；嗅球；微管蛋白质类；钙结合蛋白，维生素 D 依赖性；小白蛋白基金资助：国家自然科学基金资助项目 (81171060)摘要背景：近年来嗅球的神经发生、转化以及成熟已成为研究热点，并且嗅觉经验和神经活动能影响嗅球神经发生，但是到目前为止关于嗅觉功能活动是否影响豚鼠嗅球的神经发生尚无报道。目的： 观察单侧嗅觉功能剥夺对幼年豚鼠两侧嗅球微管聚合蛋白、维生素 D 依赖性钙结合蛋白和小白蛋白表
6、达的影响。方法：将 24 只幼年豚鼠随机分成 2 组，通过电烙铁损伤左侧外周鼻孔区建立嗅觉功能剥夺模型，分别于建立嗅觉功能剥夺模型后 3，6 周灌注取材，应用免疫组织化学技术观察不同时间点豚鼠自身两侧嗅球微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素 D 依赖性钙结合蛋白的表达情况。结果与结论：造模后 3 周组豚鼠嗅觉未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素 D 依赖性钙结合蛋白数目明显高于嗅觉剥夺侧(P 0.05)；造模后 6 周组豚鼠嗅觉未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白、小白蛋白和维生素 D 依赖性钙结合蛋白数目明显高于嗅觉剥夺侧(P 0.05)。提示豚鼠嗅觉功能活动影响神经发生和转化。曾建军，贺旭
7、，严小新，罗学港，潘爱华 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化 J.中国组织工程研究， 2014， 18(2):231-238.Unilateral olfactory functional deprivation model in the left peripheral nostrils by electric cautery injury: olfactory bulb neurogenesis and transformation Zeng Jian-jun1, 2, He Xu1, Yan Xiao-xin1, Luo Xue-gang1, Pan A
8、i-hua1 (1Department of Anatomy and Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China; 2Department of Human Anatomy, Huaihua Medical College, Huaihua 418000, Hunan Province, China)AbstractBACKGROUND: Olfactory bulb neurogenesis, transformation
9、and maturation have been considered the hot topic. Olfactory bulb experience and nervous activity can influence olfactory bulb neurogenesis. However, no study reports that olfactory bulb functions can affect olfactory bulb neurogenesis in guinea pigs.OBJECTIVE: To investigate the effect of unilatera
10、l olfactory functional deprivation on doublecortin, calbindin and parvalbumin expression in olfactory bulb of juvenile guinea pigs. METHODS: Totally 24 guinea pigs were randomly divided into two groups, which were killed after establishing olfactory functional deprivation model through electric caut
11、ery injury at the left peripheral nostrils. At 3 and 6 weeks after modeling, the specimens were harvested. The expression change of doublecortin, calbindin and parvalbumin in two sides olfactory bulb of juvenile guinea pigs was detected by immunohistochemistry. RESULTS AND CONCLUSION: The number of
12、doublecortin, calbindin and parvalbumin positive cells in olfactory 曾建军，等 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org232www.CRTER.orgbulb at the un-deprived side was significantly higher than that at the deprived side at 3 and 6 weeks (P 0.05). This finding indic
13、ates that olfactory neural activities can affect neurogenesis and transformation in guinea pigs.Subject headings: olfactory sensation; olfactory bulb; microtubular proteins; calbindin, vitamin D-dependent; parvalbuminFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81171060Zeng JJ, He
14、X, Yan XX, Luo XG, Pan AH. Unilateral olfactory functional deprivation model in the left peripheral nostrils by electric cautery injury: olfactory bulb neurogenesis and transformation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):231-238.0 引言 Introduction嗅 觉 系 统 是 自 然 界 最 古 老 、 保 存 最 完 好 的 系 统 之 一 ，嗅
15、 球 是 嗅 觉 系 统 的 重 要 组 成 部 分 ， 嗅 球 接 受 外 界 信 号 的刺 激 ， 然 后 进 行 加 工 和 处 理 1。 人 依 靠 嗅 觉 分 辨 气 味 ，而 动 物 寻 找 食 物 、 识 别 异 己 、 标 记 占 有 地 及 联 络 同 类 等活 动 主 要 依 赖 于 嗅 觉 。 嗅 球 是 一 个 层 状 结 构 ， 接 受 外 界信 息 的 输 入 后 进 行 加 工 和 处 理 。 实 验 表 明 海 马 齿 状 回 的颗 粒 下 层 和 侧 脑 室 的 室 管 膜 下 区 有 终 生 产 生 神 经 元 的 能 力 2-5， 并 且 侧 脑 室 的
16、室 管 膜 下 区 产 生 的 新 生 神 经 元 接 受了 复 杂 的 排 斥 和 吸 引 ， 经 过 “链 状 迁 移 ”到 达 嗅 球 , 嗅球 的 神 经 元 在 成 年 仍 可 不 断 的 再 生 6-8。 嗅 球 中 的 神 经 元含 有 投 射 神 经 元 和 中 间 神 经 元 两 类 ， 其 主 要 细 胞 是 僧 帽细 胞 和 簇 状 细 胞 。 近 年 来 嗅 球 的 神 经 发 生 、 转 化 以 及 成熟 已 成 为 研 究 热 点 ， 并 且 嗅 觉 经 验 和 神 经 活 动 能 影 响 嗅球 神 经 发 生 9-11， 但 是 到 目 前 为 止 关 于 嗅 觉
17、 功 能 活 动 是否 影 响 豚 鼠 嗅 球 的 神 经 发 生 却 尚 无 报 道 。 微 管 聚 合 蛋 白是 一 种 微 管 相 关 蛋 白 ， 由 360个 氨 基 酸 组 成 ， 相 对 分 子质 量 为 40 000， 其 基 因 位 点 为 Xq22.3-23， 其 主 要 作 用是 加 速 微 管 聚 合 和 稳 定 其 网 络 结 构 。 微 管 聚 合 蛋 白 能 转化 为 中 间 神 经 元 ， 它 能 特 异 性 的 表 达 于 未 成 熟 和 迁 移 神经 元 12-13， 并 且 已 经 被 证 明 是 一 个 可 靠 而 特 异 的 能 反 映神 经 发 生 的
18、 标 记 物 14-15， 除 此 以 外 跟 突 触 可 塑 性 也 相 关联 16。 在 啮 齿 类 动 物 ， 微 管 聚 合 蛋 白 的 表 达 不 仅 局 限 于海 马 的 齿 状 回 颗 粒 层 、 室 管 膜 下 区 及 嗅 球 ， 在 纹 状 体 、胼 胝 体 、 梨 状 皮 质 和 大 脑 皮 质 第 层 也 发 现 有 表 达 17-21。维 生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白 和 小 白 蛋 白 是 到 目 前 为 止 最常 见 的 和 功 能 被 研 究 明 确 的 2种 钙 结 合 蛋 白 ， 是 中 间 神经 元 的 可 靠 的 分 子 标 记 物 ， 维 生
19、 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白参 与 细 胞 内 Ca2+的 运 输 和 促 进 Ca2+的 吸 收 ， 小 白 蛋 白 是一 种 酸 性 肌 浆 蛋 白 ， 相 对 分 子 质 量 较 低 (12 000 000)，当 细 胞 兴 奋 时 ， 小 白 蛋 白 与 Ca2+结 合 ， 因 此 它 们 充 当Ca2+缓 冲 器 ， 直 接 参 与 了 胞 内 Ca2+的 存 储 浓 度 和 释 放 。通 过 中 间 神 经 元 之 间 的 相 互 影 响 ， 对 外 界 信 息 作 进 一 步的 优 化 、 加 工 和 处 理 ， 成 为 信 息 的 编 码 、 可 塑 性 、 学 习
20、、记 忆 等 功 能 的 基 础 22-24， 中 间 神 经 元 在 嗅 球 有 明 显 表 达并 且 嗅 球 有 终 生 更 生 中 间 神 经 元 的 能 力 25-28。鉴于有关幼年豚鼠嗅觉系统神经新生或神经发育是否受嗅觉功能活动的影响以及嗅觉功能剥夺是否影响未成熟神经元和中间神经元在嗅觉系统表达的数目和密度，通过电烙铁损伤左侧外周鼻孔区建立嗅觉功能剥夺模型，观察微管聚合蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白以及小白蛋白在嗅球的发育情况和表达变化，探讨嗅觉功能活动在神经发生及分化过程中的可能作用及机制。1 材料和方法 Materials and methods 设计：随机对照动物实验。时间及地
21、点：于2011年8月至2012年6月在中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系实验室完成。材料：24只幼年雄性豚鼠，健康清洁级，1周龄，体质量132 -143 g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供，许可证号：SYXK(湘)2011-0001。全身情况要求：毛发色泽光亮，身体无脱毛，四肢和尾部无畸形，无炎性疾病，颈部无歪斜。鼻部检查要求：双侧鼻孔等大和对称，无畸形。所有实验动物饲养于中南大学湘雅医学院第三附属医院实验动物部，室温保持22 ，相对湿度55% ，饲养于12/12 h光暗环境，自由饮水，给予标准饮食。所有豚鼠按随机数字表法分成2组，每组12只，单号与双号各为一组，分别作为造模后3周、
22、6 周组。每只幼年豚鼠左侧鼻孔为嗅觉功能剥夺侧，右侧为未剥夺侧，同只豚鼠的左侧嗅球与右侧嗅球相比较。实验方法： 实 验 模 型 的 建 立 ： 麻 醉 方 法 为 10%水 合 氯 醛 +5%乌 拉坦 腹 腔 注 射 (3.5 mL/kg， 水 合 氯 醛 乌 拉 坦 =1 1)， 当 动物 麻 醉 成 功 之 后 ， 用 电 烙 铁 直 接 插 入 豚 鼠 左 侧 鼻 孔 ， 在 鼻孔 内 部 烧 灼 5 s以 损 坏 嗅 黏 膜 ， 可 见 鼻 孔 内 侧 黏 膜 水 肿 ， 完全 堵 塞 鼻 孔 ， 右 侧 鼻 孔 保 持 通 畅 。 模 型 成 功 标 准 ： 动 物 在存 活 时 间
23、 点 内 左 侧 鼻 孔 保 持 完 全 封 闭 ， 没 有 穿 孔 ； 动 物 在存 活 时 间 点 内 左 侧 鼻 孔 未 发 现 感 染 以 及 伴 发 其 他 相 关 疾 病 。模 型 剔 除 标 准 ： 麻 醉 过 深 或 其 他 原 因 导 致 大 鼠 在 造 模 过 程中 或 模 型 制 作 后 死 亡 ； 动 物 在 存 活 时 间 点 内 左 侧 鼻 孔 再 度穿 孔 或 者 在 预 定 存 活 点 内 发 生 感 染 及 其 他 炎 性 疾 病 。单侧嗅觉剥夺幼年豚鼠嗅球神经发生和转化实验的主要试剂及仪器： 试剂及仪器 来源微管聚合蛋白羊抗、小白蛋白鼠抗、维生素 D 依赖性
24、钙结合蛋白鼠抗Sigma 公司DAB、生物素化广谱 Vector 公司Olympus E53 显微镜 Olympus 公司曾建军，等 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 233www.CRTER.org嗅球组织标本的制备 ：动物造模3，6 周后，10% 水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉，豚鼠被麻醉后，经左心室快速灌注，先使用生理盐水快速灌注，然后改用40 g/L多聚甲醛溶液快速灌注。取出嗅球后固定过夜、浸30%蔗糖(2次 )沉底，恒低温冰冻切片机-25 对双侧嗅球同时
25、进行连续切片。切片时采用邻切法，切片厚为30 m。免 疫 组 织 化 学 染 色 ： 微 管 聚 合 蛋 白 、 小 白 蛋 白 、 维生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白 免 疫 组 织 化 学 染 色 的 实 验 步 骤主 要 如 下 ： 把 脑 片 从 -20 冰 箱 取 出 后 复 温 1/2 h(室 温为 22 )； 0.01 mol/L PBS(pH=7.3)充 分 漂 洗 2次 ，每 次 10 min, 第 3次 用 0.01 mol/L PBS+0.1%tritonX-100缓 冲 液 (pH=7.3)漂 洗 1次 ， 10 min； 体 积 分 数 3%H2O2处 理 1
26、8 min， 漂 洗 3次 ， 方法 如 上 ； 体 积 分 数 5%马 血 清 孵 育 2 h， 然 后 加 入 一 抗(微 管 聚 合 蛋 白 、 小 白 蛋 白 、 维 生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白的 抗 体 浓 度 依 次 为 1 1 000， 1 1 000， 1 1 000)， 4 冰 箱 过 夜 ； 漂 洗 3次 ， 加 入 二 抗 (1 400)室 温孵 育 2 h； ABC复 合 物 ： A液 与 B液 提 前 1/2 h配 好 ， 浓 度比 为 1 400， 室 温 孵 育 2 h； DAB显 色 ： 显 微 镜 下 控 制显 色 时 间 ； 梯 度 乙 醇 脱
27、 水 ， 二 甲 苯 透 明 ， 中 性 树 脂 封 固 。免疫组织化学染色结果分析 ：从造模后3，6 周组嗅觉剥夺模型标本随机抽取6张嗅球免疫组织化学染色切片，在同等曝光值和象素下使用Olympus E53显微镜拍照，应用Image pro plus 6.0图像分析软件检测剥夺侧和未剥夺侧嗅球相同部位等面积下细胞浓度。主要观察指标：豚鼠微管剥夺侧和未剥夺侧嗅球聚合蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白和小白蛋白表达。统计学分析：曾建军负责统计学数据的处理，以上所有实验数据以Error! s表示，通过双因素方差分析 (Two-way ANOVA)统计不同时间点和不同组间差异。实验结果采用Prism G
28、raphPad 5.0软件进行统计分析和处理。以=0.05为检验水准，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 24只幼年豚鼠分为2组，每组12只，全部进入结果分析，无脱失。2.2 剥 夺侧和未剥 夺侧嗅球微管聚合蛋白的表达变化及阳性细胞统计结果 免疫组织化学结果显示，微管聚合蛋白在嗅球的颗粒细胞层表达非常丰富，聚集成“球”状，微管聚合蛋白除了颗粒细胞层分布密集外，在内丛状层和僧帽细胞层也广泛表达。在嗅神经层分布稀疏。幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺3周后，未剥夺侧与剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白阳性细胞相比差异有显著性意义(P 0.01)，6周组微管聚合蛋白在两侧嗅
29、球的表达情况与3周组的表达相符(P 0.01)(图 1，2)。2.3 剥夺侧和未剥 夺侧嗅球小白蛋白和 维生素D 依赖性钙结合蛋白的表达变化及阳性细胞统计结果 小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白阳性细胞在嗅神经纤维层有小量分布，绝大部分细胞分布在、突触球层，在嗅球其他4层几乎没有分布(图1，3 )。小白蛋白胞核染色明显，胞体称“吊灯”状，属于多极神经元，而维生素D依赖性钙结合蛋白胞体与小白蛋白胞体相比较，胞体较小而树突密集，错综复杂，相互缠绕，呈“球”状。幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺3周后，未剥夺侧与剥夺侧嗅球表达的小白蛋白、维生素D依赖性钙结合蛋白阳性细胞相比差异有显著性意义(P 0.01)，6周组
30、小白蛋白、维生素D 依赖性钙结合蛋白阳性细胞在两侧嗅球的表达情况与3周组的表达相符(P 0.01)(图1 ，4)。3 讨论 Discussion迄今为止，单侧嗅觉剥夺模型已成为研究体内神经元活性、代谢抑制或降低的经典模型之一 29-32，现已被广泛采用。本课题组和其他实验研究已表明该模型具有以下几个优点 33-35：属于生理功能抑制性模型，接近于生理学状态的条件下进行体内研究，与常用的嗅球切割或毒性药物引起器质性损伤诱导的神经元活性下降或抑制有本质区别；有如络氨酸氢化酶、c-fos等多种可靠的指标验证模型是否成功，减少实验操作过程的无目的性；由于是同一物种左、右两侧嗅球间进行比较，因而排除了不
31、同物种间的个体差异；手术操作简单，失败率低；重复性好制模创伤小，由于采用乙醚麻醉，避免了深度麻醉的不良反应，从而使图 1 单侧嗅觉剥夺对幼年豚鼠微管聚合蛋白、嗅球小白蛋白及维生素 D 依赖性钙结合蛋白阳性细胞浓度的影响Figure 1 Effect of unilateral olfactory functional deprivation on the density of doublecortin-positive cells, parvalbumin-positive cells and calbindin-positive cells in the olfactory bulb图注：图
32、中 A，B ，C 显示了幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺 3，6 周后，未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白、嗅球小白蛋白及维生素 D 依赖性钙结合蛋白阳性细胞数均显著高于剥夺侧(P 0.01)。未剥夺侧与剥夺侧相比， aP 0.01。A B Caa a a a未剥夺侧剥夺侧未剥夺侧剥夺侧未剥夺侧剥夺侧 8 0006 0004 0002 0000维生素D依赖性钙结合蛋白阳性细胞/mm210 0008 0006 0004 0002 0000小白蛋白阳性细胞/mm23 周 6 周3 周 6 周a3 周 6 周50 00040 00030 00020 00010 0000微管聚合蛋白阳性细胞/mm2曾建军，等 . 电
33、烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org234www.CRTER.org动物存活率高。嗅球是一个层状结构，从内到外嗅球可分为6层 36：颗粒 细 胞 层 、 内 丛 状 层 、 僧 帽 细 胞 层 、 外 丛 状 层 、 突 触 球层 和 嗅 神 经 层 。 已 有 大 量 研 究 表 明 ， 嗅 觉 剥 夺 能 引 起 兔 子 、家 猫 、 豚 鼠 、 非 灵 长 类 动 物 的 嗅 球 体 积 下 降 37-39； 早 期 嗅 觉剥 夺 改 变 嗅 脑 脑 区 ， 使 嗅 脑
34、结 构 发 生 变 化 40； 与 此 同 时 气味 剥 夺 还 能 减 少 嗅 球 神 经 发 生 和 神 经 元 的 存 活 时 间 41-42。图 2 幼年豚鼠单侧嗅球剥夺后 3 周和 6 周嗅球微管聚合蛋白阳性细胞分布和表达情况Figure 2 The distribution and expression of doublecortin-positive cells in olfactory bulb at 3 and 6 weeks after unilateral olfactory functional deprivation in juvenile guinea pigs图注
35、：(1) GCL 为颗粒细胞层，IPL 为内丛状层，MCL 为僧帽细胞层。(2) 图中 A1，B1，C1，D1 分别是 A，B ，C，D 的局部放大图。A2，B2，C2 ，D2 分别是 A1，B1，C1，D1 的局部放大图。(3) 幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺 3 周后，未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白阳性细胞数显著高于剥夺侧(P 0.01)，6 周组微管聚合蛋白在两侧嗅球的表达情况与 3 周组的表达相符(P 0.01)。(4) 图的标尺为 A，B，C，D=100 m；A1，B1，C1 ，D1=50 m；A2， B2，C2 ，D2=10 m。(5) 图中 A 为嗅觉未剥夺 3 周组。(6) 图中 B 为
36、嗅觉剥夺 3 周组。(7) 图中 C 为嗅觉未剥夺 6 周组。(8) 图中 D 为嗅觉剥夺 6 周组。曾建军，等 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 235www.CRTER.org图 3 幼年豚鼠单侧嗅球剥夺后 3 周和 6 周嗅球小白蛋白阳性细胞的分布和表达情况 Figure 3 The distribution and expression of parvalbumin-positive cells in olfactory bulb at 3 and 6 weeks a
37、fter unilateral olfactory functional deprivation in juvenile guinea pigs图注：(1) 图中 EPL 为外丛状层， GL 为突触球层，ONL 为嗅神经层。(2) 图中 A1，B1，C1，D1 分别是 A，B ，C，D 的局部放大图。A2，B2，C2 ，D2 分别是 A1，B1，C1，D1 的局部放大图。(3) 图中幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺 3 周后，未剥夺侧嗅球表达的小白蛋白阳性细胞数显著高于剥夺侧(P 0.01)，6 周组小白蛋白在两侧嗅球的表达情况与 3 周组的表达相符 (P 0.01)。(4) 图中标尺为 A，B，C，D=
38、100 m；A1，B1，C1 ，D1=50 m；A2， B2，C2 ，D2=10 m。(5) 图中 A 为嗅觉未剥夺 3 周组。(6) 图中 B 为嗅觉剥夺 3 周组。(7) 图中 C 为嗅觉未剥夺 6 周组。(8) 图中 D 为嗅觉剥夺 6 周组。曾建军，等 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org236www.CRTER.org图 4 幼年豚鼠单侧嗅球剥夺后 3 周和 6 周嗅球维生素 D 依赖性钙结合蛋白阳性细胞的分布和表达情况 Figure 4 The distrib
39、ution and expression of calbindin-positive cells in olfactory bulb at 3 and 6 weeks after unilateral olfactory functional deprivation in juvenile guinea pigs图注：(1) 图中 EPL 为外丛状层， GL 为突触球层，ONL 为嗅神经层。(2) 图中 A1，B1，C1，D1 分别是 A，B ，C，D 的局部放大图。A2，B2，C2 ，D2 分别是 A1，B1，C1，D1 的局部放大图。(3) 图中幼年豚鼠左侧嗅觉剥夺 3 周后，未剥夺侧嗅球
40、表达的维生素 D 依赖性钙结合蛋白阳性细胞数显著高于剥夺侧(P 0.01)，6 周组维生素 D 依赖性钙结合蛋白在两侧嗅球的表达情况与 3 周组的表达相符(P 0.01)。(4) 图中标为 A，B，C，D=100 m；A1，B1，C1 ，D1=50 m；A2，B2，C2 ，D2=10 m。(5) 图中 A 为嗅觉未剥夺 3 周组。(6) 图中 B 为嗅觉剥夺 3 周组。(7) 图中 C 为嗅觉未剥夺 6 周组。(8) 图中 D 为嗅觉剥夺 6 周组。曾建军，等 . 电烙铁损伤左侧外周鼻孔区构建单侧嗅觉剥夺模型：嗅球神经的发生和转化ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODE
41、N: ZLKHAH 237www.CRTER.org本实验中发现大量的未成熟神经元集中于颗粒细胞层，这是因为海马齿状回的颗粒层和室管膜区终身产生神经干细胞，它们沿着嘴侧迁移流通过“链状迁移”达到嗅球，大部分细胞在颗粒细胞层分化成颗粒细胞，这与Lledo等43的研究结果是一致的。在3周和6周2 个时间点，幼年豚鼠的未剥夺侧嗅球表达的微管聚合蛋白阳性细胞多于剥夺侧，差异有显著性意义( P 0.01)，其原因可能是：嗅球剥夺延缓或者阻碍了嗅球新生神经元突触的发育，从而增加个体神经元内部兴奋性抑制突触密度 44；剥夺侧嗅球接触不到外界信号的刺激，产生新生神经元的速度下降甚至是不能产生新生神经元，而未剥
42、夺侧嗅觉正常，嗅觉刺激可以促使嗅球产生新生神经元同时还可以使新生神经元的存活时间延长 45，此外未成熟神经元和新生神经元不断整合到嗅觉环路，改变原有的神经网络。中 间 神 经 元 (Interneuron)又 称 为 联 络 神 经 元 ， 是 神 经元 之 间 相 互 联 系 的 桥 梁 。 大 部 分 中 间 神 经 元 是 抑 制 性 神 经元 ， 使 用 -氨 基 丁 酸 作 为 神 经 递 质 。 广 泛 的 说 ， 中 间 神 经元 控 制 神 经 元 网 络 3个 组 成 部 分 ， 其 中 树 突 输 入 ， 轴 突 输 出 。维 生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白 和
43、小 白 蛋 白 是 到 目 前 为 止 最 常见 的 和 功 能 较 为 明 确 的 2种 钙 结 合 蛋 白 46， 维 生 素 D依 赖 性钙 结 合 蛋 白 参 与 了 细 胞 内 Ca2+的 运 输 和 促 进 Ca2+的 吸 收 ，小 白 蛋 白 是 一 种 酸 性 肌 浆 蛋 白 ， 当 细 胞 兴 奋 时 ， 小 白 蛋 白与 Ca2+结 合 ， 因 此 它 们 充 当 Ca2+缓 冲 器 ， 直 接 参 与 了 胞 内Ca2+的 存 储 浓 度 和 释 放 47。 小 白 蛋 白 中 间 神 经 元 针 对 的 是细 胞 的 胞 体 ， 小 白 蛋 白 几 乎 全 部 都 表
44、达 于 -氨 基 丁 酸 ， 呈树 枝 状 或 蓝 状 ， 维 生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白 针 对 的 是 神 经元 的 轴 突 。 本 实 验 发 现 小 白 蛋 白 和 维 生 素 D依 赖 性 钙 结 合 蛋白 则 主 要 分 布 在 突 触 球 层 ， 这 可 能 是 由 于 绝 大 部 分 细 胞 在颗 粒 细 胞 层 分 化 成 颗 粒 细 胞 ， 只 有 少 数 细 胞 在 突 触 球 层 分化 成 中 间 神 经 元 。 本 实 验 发 现 小 白 蛋 白 阳 性 细 胞 形 态 呈 树枝 状 或 蓝 状 ， 胞 体 明 显 ， 与 Celio48报 道 一 致
45、， 并 且 维 生 素D依 赖 性 钙 结 合 蛋 白 和 小 白 蛋 白 主 要 分 布 在 突 触 球 层 和 嗅神 经 层 。在3周和6周2 个时间点作者发现小白蛋白和维生素D依赖性钙结合蛋白的表达情况与Double Cortin表达一致，这可能是由于微管聚合蛋白能转化成中间神经元 49，具体说就是实验已经证明未剥夺侧的未成熟神经元数目多于剥夺侧，那么未剥夺侧的未成熟神经元转化成转化成中间神经元的细胞也有可能多于剥夺侧；也有可能是嗅觉功能剥夺之后阻断了嗅觉传导通路，因而不能诱发动作电位产生神经冲动。总之，实验结果表明神经元功能活动能影响神经发生和转化，至于其作用的分子机制会在以后的实验中
46、进一步研究和阐述。致谢 ：向对于文章提供帮助和支持的中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物系以及怀化医学高等专科学校的各位老师表示衷心的感谢，感谢 蔡艳老师在实验设计 及论文写作方面提供的宝贵意见。利益冲突 ：文章及内容不涉及相关利益冲突。作者贡献 ：曾建军和贺旭负责单侧嗅觉剥夺模型建立、数据分析以及整理；罗学港和严小新负责课题设计以及思路；潘爱华对文章负责及审校。 实验采用盲法评估。伦理要求 ：实验过程中对动物的处置符合 2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。学术术语 ：神经发生(neurogenesis)-是包括
47、从神经干细胞增殖并经历均衡和不均衡性分裂成为定向祖细胞，并逐渐向功能区域迁移、不断发 生可塑性变化并与其他神 经元建立突触联系从而产生神经功能的完整的过程。作者声明 ：文章为原创作品，无抄 袭 剽窃，无泄密及署名和 专利争议，内容及数据真 实，文 责自负 。4 参考文献 References1 Leinwand SG, Chalasani SH. Olfactory networks: from sensation to perception. Curr Opin Genet Dev. 2011;21(6): 806-811.2 Pan A, Li M, Gao JY, et al. Expe
48、rimental epidural hematoma causes cerebral infarction and activates neocortical glial and neuronal genesis in adult guinea pigs. J Neurosci Res. 2013; 91(2): 249-261.3 Mu Y, Lee SW, Gage FH. Signaling in adult neurogenesis. Curr Opin Neurobiol. 2010;20(4): 416-423.4 Zhao C, Deng W, Gage FH. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 2008;132(4): 645-660.5 Ma DK, Bonaguidi MA, Ming GL, et al. Adult neural stem cells in the mammalian central nervous system. Cell Res. 2009; 19(6): 672-682.6 Chen R, Lin C, You Y,
