1、1实验一 光学显微镜的操作及细菌、放线菌和蓝细菌个体形态的观察、显微镜的使用一、实验原理 微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜(16mm，10)高倍物镜(4mm，40-45)和油镜(1.8mm，95-100)三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率 n1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后， 可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样
2、视野的照明度就减低了(图-1)。利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： 2sinAN式中 数 值 孔 径 介 质 折 射 率入数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。 AN2能 辨 别 两 点 间 最 小 距 离式中 =光波波长由上述可知若 n值和 角越大则 NA 越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大(图-2)。2一些物质的折射率：水 1.33 玻璃 1.52
3、 空气 1.0 香柏油 1.515。二、实验器材1、 仪器 显微镜；2、 材料 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。三、操作步骤1、取镜 显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图-32、调节光源1) 将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为 0.5厘米左右。2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距 1毫米左右。图-3 光学显微
4、镜的构造1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋 13. 镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋3) 左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜)。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则
5、光线过强不易观察。3、低倍镜观察 低倍物镜 (8或 10)视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：1) 先将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)，并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约 0.5厘米处。2) 左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。33) 移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。4、高倍镜观察 将高倍物镜 (40)转至镜筒下方(在转换物镜时
6、，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。5、油镜观察1) 用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改
7、用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。3) 如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。4) 观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。5) 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。四、注意事项1、显微镜镜头的保护和保养2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线、细菌、放线菌和蓝细菌个体形态的观察一、仪器和材料1、 显微镜、擦镜纸、香
8、柏油或液体石蜡、二甲苯。2、 示范片：大肠杆菌（杆状） 、小球菌（球状） 、硫酸盐还原菌（弧形） 、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。二、试验内容和操作方法1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。42、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。实验二 酵母菌、霉菌、藻类、原生动物及微型后生动物个体形态的观察一、实验目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法。2、观察几种真核微生物的个体形态，掌握生物图的绘制方法。3、学习压片滴法制
9、作标本片。二、仪器和材料1、显微镜、擦镜纸、吸水纸。2、酵母菌、霉菌示范片，藻类培养液及生活污泥混合液。三、试验内容和操作方法1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察酵母菌和霉菌示范片，用铅笔分别绘出其形态图。2、用压滴法制作藻类、原生动物和微型后生动物的标本片。方法：取一片干净的载玻片放在试验台上，用一支滴管吸取试管中藻类培养液于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要产生气泡）即成标本片，然后用低倍镜和高倍镜观察（教师示范） 。3、用压滴法观察原生动物和微型后生动物（制作方法同上） 。思考题你一共观察到几种微生物，绘出他们的形态图。5实验三 微生物的染色、细菌
10、简单染色法一、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际
11、上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为 M B C)；它可被电离成正、负离子：M B Cmethylene blue chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。染色前必须先固定细菌，其目
12、的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。二、实验器材1、 菌种 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；2、 仪器 显微镜；3、 材料 接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水纸；4、 染料 草酸铵结晶紫或石碳酸复红。三、操作步骤1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。62、干燥 将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰
13、高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。3、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰 2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料；4、染色 玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染 l-2min。5、水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。6、干燥 自然干燥或用吸水纸 盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。7、镜检 用油镜观察并绘出细菌形态图。8、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。四、注意事项1、玻片要洁净无油，
14、否则菌液涂不开。2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。、革兰氏染色法一、实验原理革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 CGram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G -)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂-碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为 G菌和 G-菌
15、，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G -菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。二、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面 28培养 24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面 28培养 16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；
16、73、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；三、操作步骤1、 涂片 在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。2、 固定 将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰 1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。3、 染色初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色 1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染 滴加(Lugol)碘液，染 1-2min，水洗。脱色 滴加 95%乙醇，脱色 20-25s立即水洗，以终
17、止脱色。复染 滴加蕃红，染色 2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。4、 镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌 (G)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G -)。四、注意事项1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。2、染色过程中
18、勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3、选用培养 16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。实验四 培养基的制备和灭菌、培养基的制备一、实验原理培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也8各有差异。但是，不同种类和不
19、同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH 值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固
20、体培养基。固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在 95的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到 45才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25-37)不会融化而保持固体状态。二、实验器材1、 药品 琼脂，1N NaOH溶液，1N HCl溶液，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基的配方药品；2、 材料 具刻度 1000毫升塘瓷盅或小铝锅，天平，10200mm 试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，p
21、H 试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签。三、操作步骤1、计算称量 根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。2、溶解 一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，补足水分到需要的总体积。3、调节 pH 用滴管逐滴加入 1N NaOH或 lN HCl边搅动；边用精密的 pH试纸测其 pH值，直到符
22、合要求时为止。pH 值也可用 pH计来测定。4、过滤 要趁热用四层纱布过滤。A.培养基的分装9B.棉塞的做法1.正确 2.管内太短，外部太松3.整个棉塞太松 4.管内太紧，外部太短松图-1 培养基的分装装置与棉塞5、分装 按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。6、加塞 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质
23、量的好坏对实验的结果有很大影响。7、灭菌 在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。如果分装的斜面，要趁热摆放并使斜面长度适当(为试管长度 1/3-l/2，不能超过 1/2)。培养基经灭菌后，应保温培养 2-3天，检查灭菌效果，无菌生长者方可使用。四、注意事项1、 配制固体培养基用的琼脂应先行用冷水浸泡，纱布过滤，在调好 pH值后加入。2、 配制高氏一号合成培养基时应小心溶解淀粉，不要成团。、灭菌与消毒灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物
24、体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养 不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。一、消毒与灭菌的方法消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。、加热法加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。1、干热灭菌10有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气 160-17
25、0下保温 2小时进行灭菌。2、湿热灭菌高压蒸汽灭菌法 此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内 1.05kgcm 2(15磅/英寸 2)，121.3保持 15-30分钟进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化、以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。间歇灭菌法 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌。该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到 100时，即循环流于器内，水蒸汽碰到器内物体时，又凝成水，流至底层贮水处，故不至干涸。灭菌时，将培
26、养基放在器内，每天加热10030 分钟、连续三天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养基取出放室温下 18-24小时，使其中的芽孢发育成为营养体，第二日再加热 l0030分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。一般凡能用高压蒸汽灭菌的物品均不采用此法灭菌。煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为 10-15分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。、过滤灭菌许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有蔡氏(Sei
27、tz)过滤器和膜过滤器。蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节、过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板，蔡氏过滤器的结构如图。滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素(乙酸纤维素或硝酸纤维素)，孔径一般为 0.45m， 过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。、紫外线灭菌紫外线波长在 200-300nm，具有杀菌作用，其中以 265-266nm杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。、化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3-5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等，见表-1。
