1、分子实验基本操作培训,余涛，郑勤思2008-4-13,Outline,分子实验基本流程介绍分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项总结,分子实验基本流程介绍,感受态的制备,PCR克隆目的片断,酶切及酶切片断回收（电泳）,连接,小提质粒并酶切鉴定（电泳）,大肠杆菌的培养,转化,分子实验基本流程介绍,感受态的制备,PCR克隆目的片断,酶切及酶切片断回收（电泳）,转化,连接,小提质粒并酶切鉴定（电泳）,大肠杆菌的培养,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,原理 大肠杆菌在37 下在较好较快的进行增殖， 4 下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80 用15-20%甘油冻存） 由于转入的质粒带有抗性标
2、记，用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。分为固体培养基培养和液体培养基培养,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,Step0: LB培养基的配制(1L培养基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分) 1L 去离子水一般一瓶配100-300mLStep0: 灭菌（此后一切保持无菌操作）,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,固体培养基培养 （用于筛选或短期保存菌种）Step1: 倒板 微波炉加热培养基 - 室温冷却至60 左右 - 移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀
3、释1000倍），摇匀 - 趁热快速倒入平板，12mL/板 - 超净台内室温冷却凝固Step2: 接种 划线法：烧红接种环 - 冷却 - 蘸上菌液 - 在平板上划线 -灼烧接种环。 多用于菌种保存 平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,固体培养基培养Step3：37培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时，防止突变株产生。Step4：培养结束后，需放入4 冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,液体培养基培养（用于扩增）Step1：
4、取出适量培养液于锥形瓶或试管。Step2: 加入适量抗生素。Step3：将目标菌落挑入培养液。（可用接种环或枪头）Step4: 将培养液放入37 摇床中培养，转速一般为220rpm。（为什么要摇？）,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,注意事项：无菌操作！抗生素加入的时机及量培养时间（不可过长）返回,分子实验基本操作感受态的制备,原理： 感受态 - 可接受外来DNA的状态 CaCl2法制备 Ca2+可以使膜骨架发生改变，产生膜 上的小孔洞，并可使DNA分子结合并进入细胞内。步骤：比较麻烦，属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备，因此不需经常进行。注意事项：感受态制备后应立即冻存于-80。使用时
5、不可反复冻融。返回,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,原理： 限制性内切酶： 1）发现于细菌中，用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。 2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致） 3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。）分类：单切和双切,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,单切：Step1: 酶切体系的选定 确定选用的酶 - 查找对应高效率的buffer（常用的buffer有H, M, L, K, T 五种），确定要不要加BSAH, M, L, K, T buffer 都有什么？ H-High,
6、M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-AcetateB-L, G-M, O-H, R-K, Tango-T,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,Step2: 配制酶切体系：以10uL体系为例 0.5uL 内切酶（含50%甘油防冻） 1uL Buffer (10*) 5uL 质粒 3.5uL 去离子水原则： 1） 甘油含量不可超过总体系5%，防止星火性 2） 质粒可根据具体情况调整 3） 内切酶切记不可置于常温！,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,Step3: 置于37培养箱中，温育2-4h。（用水浴也可以，但可能会使溶液因蒸发而产生浓度不均匀）。注意有些特殊的酶所需的条
7、件有所不同，主要是温度条件。Step4: 纯化，方法同PCR片段纯化。Step5: 电泳检测,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,双切：Step1: 酶切体系的选定 确定选用的两种酶 - 查找对应双切的Buffer，同时看与分别单切的高效buffer是否吻合 - 确定要不要加BSAStep2: 配制酶切体系。与单切类似，但需要注意酶的用量。（甘油含量不可超5%.）Step3: 37温育2-4hStep4: 凝胶回收,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集纯化。Step1: 电泳，电泳过程中称重一小离心管。Step2: 电泳结束后，将凝胶置于成像仪内。Step3: 戴上手套，持小刀，将小刀灼烧后冷却，隔着防护挡板，打开紫外，迅速将目标片段处凝胶切下。Step4: 关闭紫外，称重，根据kit protocol进行余下试验。返回,
