1、细胞增殖和凋亡异常与疾病病理生理学教研室 王曜晖,引 言,增殖：使细胞的数量增加分化：形成特定形态、结构和生理功能的子代细胞（造血干细胞）凋亡：清除体内无能的、有害的、突变的、受损的细胞 以此来保证细胞的数量和质量。,第一节 细胞增殖异常与疾病,细胞增殖：(cell proliferation)细胞分裂和再生的过程。细胞通过分裂进行增殖，使遗传信息传给子代，保持物种的延续性和数量增多。 细胞增殖是通过细胞周期来实现的,一、细胞周期的概述,1、细胞周期：细胞增殖周期，是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂终了的过程或间隔时间。 2、细胞周期分为四个阶段： G1期、 S期、 G2期、 M期 是否所有细
2、胞都处于细胞周期内？,根据细胞的增殖特性可以分为三种：1、周期性细胞：也称为连续分裂细胞。按G1期、 S期、 G2期、 M期循环，连续运转。 如表皮细胞和骨髓细胞等。处于增殖和死亡的动态平衡，称为稳态更新。2、 G0期细胞：也称为休眠细胞。可暂时脱离细胞周期，不进行增殖,需要合适的刺激才可以进入细胞周期。如肝细胞和肾细胞。条件性更新。3、终端分化细胞：也称为不分裂细胞。不可逆的脱离细胞周期，丧失增殖能力，但具有一定生理功能。 如神经细胞和心肌细胞,细胞周期特点：,1、单向性2、阶段性3、检查点4、受细胞微环境影响,二、细胞周期的调控,（一）细胞周期自身调控（二）细胞外信号对细胞周期调控,（一）
3、细胞周期自身调控,细胞周期素或周期蛋白（ Cyclin ） 周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase，CDK） CDK抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CDI） 检查点（check point）,细胞周期及调节,1、细胞周期素或周期蛋白（ Cyclin ） 哺乳动物细胞至少有8种cyclin,14个成员。 在不同的细胞周期阶段起作用。即G1期、 S期、 G2/ M期,Cyclin周期变化图,（1）Cyclin 作为调节亚基 需要与催化亚基CDK形成复合物，激活相应的CDK，加强CDK对特定底物的作用，驱动细胞周期前行。 （
4、2）CDK周期性的活性变化与cylin有关。 （3）增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）DNA聚合酶的附属蛋白，促进DNA聚合酶延伸DNA，S期标志物。,2、周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase，CDK）,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，各成员有不同程度的同源性，故称为CDK家族（9成员） （1） CDK的激活依赖于cyclin的结合和自身分子中氨基酸残基的磷酸化状态。（自身的活化和抑制部位），还与CDK活化激酶（CAK）有关。 （2） CDK的灭活除了与泛素介导的蛋白水解体系有关，CDI也可抑制其活性。,3、
5、CDK抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CDI）,哺乳类细胞主要包括Ink4(inhibitors of kinase 4)和Kip（kinase inhibitory protein也称Cip）（1）Ink4是一组CDK4的抑制蛋白，可特异性的与CDK4/6结合，防止后者再结合cyclin或降低cyclin-CDK复合物的稳定性，以抑制其活性。其成员包括P15，P16，P18，P19。 P16在S期达到峰值，G1/S期限制点负调控的重要组成部分。,（2） Kip（kinase inhibitory protein也称Cip）Kip是一组CDK抑制蛋
6、白，经非共价键与cyclin-CDK复合物结合起抑制作用。其家族成员包括P21,P27和P57，特点是N末端具有高度的结构和功能相似性，可抑制几种蛋白酶活性。,其家族成员P21,P27研究较透彻。 P21作用较强，作用谱较广，主要调控细胞周期确保遗传物质精确传递给下一代，以消除由于DNA的损伤而引发肿瘤，还参与细胞应激状态的信号传导。,P27为停止细胞分裂所必需，在休止细胞内高表达，而在增殖细胞内低表达。,4、检查点（check point）,生物进化的过程中，细胞发展出一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制。 DNA 损伤检查点 G1/S Checkpoint DNA复制检查
7、点 S/G2 纺锤体组装检查点 G2/M 检查点由探测器、传感器和效应器,（二）细胞外信号对细胞周期调控,细胞外信号包括细胞因子、激素、基质和营养等。分为增殖信号和抑制信号,抑制信号（TGF-） 可以下调cyclin和CDK4的表达和促进P21、P27和P15等CDI产生，使细胞阻滞在G1期。,pRb,E2F,（EGF、IGF、IL）,增殖信号,（三）细胞周期调控异常与疾病,细胞周期调控异常可导致细胞增殖过度或细胞增殖缺陷。无论细胞增殖过度还是增殖缺陷都会导致一些疾病的发生。,（一）细胞增殖过度,细胞增殖过度可导致较多疾病，包括肿瘤、肝肾纤维化、前列腺肥大、原发性血小板增多症、家族性红细胞增多
8、症、类风湿性关节炎、银屑病、肾小管间质性疾病、动脉粥样硬化等。,1、 Cyclins异常（与其他癌基因协同作用）肿瘤的发生与cyclin（D、E）过量表达有关。 【Cyclin D1（Bcl-1）过表达原因】（原癌基因）基因扩增（Cyclin D1过表达的主要机制） 染色体倒位（Chromosome inversion）甲状旁腺腺癌发生染色体倒位，Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制下 ，Cyclin D1蛋白合成染色体易位（Chromosome translocation)：Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 ， Cycl
9、in D1表达乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因扩增过度。,2、CDK 表达异常主要见于CDK4、CDK6过表达。其中CDK4可能是TGF-B介导细胞增殖抑制的靶蛋白。（TGF-B 能抑制其CDK4的mRNA和蛋白的表达）细胞分化过程中，常有CDK4表达的下调。高浓度的CDK4能对抗P15的抑制作用。CDK4的高表达抑制细胞分化，导致肿瘤的发生。,（2）Kip含量减少Kip能抑制多种CDK活性，在细胞分化和细胞周期检测中起到及其重要的作用。P21表达减弱或消失使细胞增殖过度，细胞分化不良，导致肝癌、黑色素瘤和骨肉瘤的发生P27的表达降低常与肿瘤发生、分级、分化和预后有关。可导致乳腺
10、癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌,4、检查点功能障碍,主要原因：G1/S、G2/M检查点异常P53基因（分子警察） P53丢失可使细胞易于产生药物诱导的基因扩增和细胞分裂，降低染色体准确度。如果发生P53遗传突变引起Li-Fraumeni癌症综合症G2/M DNA双链断裂，激活DNA损伤检查点，阻止细胞进入M期，诱导修复基因转录 ，完成断裂的DNA修复，失去G2/M检查点的阻滞作用，染色体发生重排、丢失。,原发性血小板增多症（PT）,银屑病,（二）细胞增殖缺陷,细胞增殖缺陷会导致很多疾病，如糖尿病肾病、神经退行性疾病和再生障碍性贫血糖尿病肾病中无Cyclin和CDK的改变，但是P27增
11、多，pRb低磷酸化状态抑制肾小管上皮细胞、系膜细胞或血管内皮细胞的增殖,衰老,衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆的丧失增殖能力后进入一种相对稳定状态。CyclinD和E含量增加，cyclin-CDK复合物的活性降低(磷酸化水平降低)，CDI（P15,P16和P21过表达）,四、调控细胞周期与疾病的防治,1、合理利用增殖相关信号（EGF与乳腺癌、神经生长因子与神经退行性疾病）上皮生长因子作为生长信号在非激素依赖型乳腺癌的发病机制中有着十分重要的意义。该信号可通过与受体结合激活受体酪氨酸激酶系统，经过Ras和Akt等途径激活NF-kB，提高CDK活性，促进肿瘤细胞增殖神经细胞受损伤时，给予外源性的神经
12、生长因子。,2、抑制Cyclin和CDK的表达和活性 向肿瘤细胞注射cyclin抗体或反义核苷酸可在一定程度上抑制肺癌细胞由G1期向S期过度，并逆转细胞形态。 CDK抑制剂Flavopiridol是一种作用谱较广的CDK抑制剂，纳摩尔水平就可以抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK6，从而使细胞停滞于G1/S和G2/M.,3、提高CDI的表达和活性 将外源性p27转染人星形瘤细胞、乳腺癌和鼻咽癌细胞，能抑制其生长，逆转其表型，减少非整倍体细胞，同时使G2/M期细胞增多。 将P21cDNA转染入甲状腺、脑、肺和直肠癌等瘤细胞，可抑制其生长和增强其对化疗的敏感性。 TGF-B处理细胞，可使P27
13、表达增多。,4、修复和利用缺陷的细胞周期检查点 多数肿瘤可以发现P53基因异常。 通过转染野生型P53，可以修复细胞周期检查点，可使肿瘤细胞的恶性表型部分逆转。,细胞凋亡异常与疾病cell apoptosis and diseases,第一节、概述,坏死,凋亡,正常细胞,增殖、分化,死亡,细胞凋亡(apoptosis)名称的由来,1972年 Kerr教授,from,fall,凋亡(apoptosis),由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。也叫程序性细胞死亡。,细胞坏死与凋亡的差异,细胞凋亡的生理意义,1、 确保正常发育、生长,2、 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老
14、的细胞3、 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡,第二节 细胞凋亡的过程与调控,一、细胞凋亡的大致过程二、凋亡时细胞的主要变化三、细胞凋亡的调控,一、细胞凋亡的大致过程,凋亡细胞的形态学改变,早期：胞浆脱水，胞膜空泡化，细胞固缩，出芽晚期：染色质边集，凋亡小体（apoptosis body:凋亡过程中胞膜内陷，分割包裹胞浆、核碎片形成的泡状小体，是凋亡细胞的特征性形态改变）最后：被附近的巨噬细胞吞噬消化,二、细胞凋亡时的主要变化,凋亡时细胞的形态学改变,细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化,凋亡小体,核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小,胞膜内陷出芽,浓缩核裂解膜自行分割,邻近的上
15、皮细胞、M、瘤细胞等吞噬凋亡小体,Normal Cell,Apoptotic cell,凋亡细胞的生化改变,内源性核酸内切酶激活切割染色质DNA，Ca2+/Mg2+(+) ，Zn2+ (-) DNA片段化内切酶在核小体切开DNA，形成大小是180-200bp的整数倍数的片段，电泳呈“梯状”条带凋亡蛋白酶（Caspases）激活 (caspases：cysteine-containing asparate-specific protease) Caspases的活性中心富含半胱氨酸，对底物天冬氨酸部位有特异的水解作用,Caspase在凋亡中作用：灭活细胞凋亡抑制物（如Bcl2）水解细胞的蛋白结构
16、，导致细胞解体，形成凋亡小体水解凋亡相关活性蛋白,细胞坏死与凋亡的差异,鉴定细胞凋亡的常用方法,特性 推荐使用手段 说明,形态学细胞表面改变 扫描电镜 微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体胞浆改变 相差显微镜 细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡染色质凝聚核裂解相差显微镜或光镜 适用于组织切片 荧光显微镜 用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞 流式细胞仪 定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于 培养细胞超微结构 透射电镜 完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解, 凋亡小体适用于组织切片或培养细胞生化改变DNA裂解 琼脂糖凝胶电泳 梯状条带 磁场反转凝胶电泳 可测50bp或300bp的HMW片段
17、TUNEL法 原位缺口平移法基因表达 可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、 原位杂交、Northern印迹法等,三、细胞凋亡的调控,（一）凋亡的相关因素（凋亡信号）（二）凋亡信号的转导与凋亡执行（三）凋亡相关基因（四）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬,（一）凋亡信号1、生理性凋亡信号,（1）某些激素和细胞因子直接作用 （糖皮质激素和淋巴细胞、甲状腺激素和青蛙、TNF、谷氨酸和皮质神经元）（2）某些激素和细胞因子间接作用 （睾丸酮和前列腺上皮细胞、促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质细胞）,2、病理性凋亡信号,如生物化学毒素、药物、射线、应激和病毒感染、营养缺乏、过度的功能负荷等。以上因素超过一定范
18、围就会引起细胞坏死。 并非所有的有害物质都能引起凋亡，例如：化学促癌物和EB病毒等。 氧化应激、死亡受体激活、线粒体功能改变。,（二）凋亡信号的转导,1、死亡受体介导的凋亡通路2、线粒体介导的凋亡通路,1死亡受体通路（Extrinsic or cytoplasmic pathway）死亡受体 TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。通路（pathway）,Fas蛋白是胞膜上的跨膜蛋白，属于TNF受体家族。介导凋亡可能机制：与Fas配体（抗Fas 抗体）结合,与抗Fas 抗体或TNF结合,ICE样caspase,组蛋白降解,暴露出核酸内切
19、酶酶切位点, Fas蛋白激活后可以通过钙信号系统引起凋亡,注：ICE(IL-1 converting enzyme),细胞凋亡异常,2、内源性核酸内切酶,（三）凋亡相关基因,抑制凋亡基因：Bcl-2（EIB、IAP）促进凋亡基因: P53（ Fas 、Bax、ICE）双向调控基因: c-myc、Bcl-x,第一个被确认的抑制凋亡基因抑制凋亡机制：1.直接抗氧化2.抑制线粒体释放的促凋亡的蛋白质, 如Cyt c、AIF3.维持钙稳态4.抑制凋亡蛋白酶的激活5.抑制促凋亡因子Bax、Bak的细胞毒作用,B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)
20、,P53 野生型诱导凋亡,P53 突变或缺失时凋亡减弱,C-myc，Bcl-x（双向调节）,C-myc,生长因子(+) 诱导增殖生长因子(-) 诱导凋亡,Bcl-x,翻译,Bcl-XL 抑制凋亡Bcl-XS 促进凋亡,（四）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬,正在凋亡的细胞以及凋亡小体的最终结局是被临近的吞噬细胞或正常细胞迅速识别和吞噬，进而被吞噬细胞内的溶酶体酶彻底消灭1、吞噬细胞凝集素的作用（糖类）2、血小板反应蛋白介导吞噬（中性粒细胞）3、磷脂酰丝氨酸受体的作用（外层为中性磷脂，内层为磷脂酰丝氨酸）,细胞凋亡与疾病,正常机体细胞生长与死亡的平衡,生长,坏死、凋亡,正常机体,细胞凋亡与疾病,一
21、、凋 亡 相 对 不 足,肿瘤、自身免疫性疾病等,（一）肿瘤肿瘤的重要发病机制: 细胞增殖过度 细胞凋亡受抑、死亡不足 病变组织内细胞增殖死亡, 肿瘤细胞数目的净增长加大 可能机制：Bcl-2高表达、P53基因突变 从发病学上，细胞凋亡实际是机体天然的抗癌机制之一,（二）病毒感染性疾病 病毒感染中，病毒和宿主通过调控细胞凋亡的速率以利于自身生存1、灭活P53(腺病毒)2、产生与Bcl-2样蛋白（腺病毒）或上调Bcl-2表达（EB病毒）3、灭活Caspases(痘病毒),（三）自身免疫病正选择,与非己抗原MHC抗原结合的TCR单阳性细胞存活,针对自身抗原的T细胞被清除,负选择,如果负选择失调，会
22、引起自身免疫病（胰岛素依赖型糖尿病、慢性甲状腺炎）,二、细 胞 凋 亡 过 度,神经退行性疾病、造血衰竭性疾病、心肌缺血/再灌注损伤,（一）心血管疾病,1、心肌缺血与缺血再灌注损伤其细胞凋亡有如下特点：（1）缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主（2）梗死中央以坏死为主，周边以凋亡为主（3）轻度缺血以凋亡为主，重度以坏死为主（4）一定时间内，再灌注损伤凋亡更加严重（5）急性、严重心肌缺血以坏死为主 慢性、轻度心肌缺血以凋亡为主,2、心力衰竭 心衰过程中，氧化应激、压力负荷等可诱导 心肌细胞凋亡。 心衰时心肌凋亡指数（凋亡/正常细胞核） 增高。 心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少也可能是心力衰竭发生、
23、发展的主要原因之一,（二） 神经退行性疾病 如Alzheimer disease，Parkinson disease，多发性硬化症等 引起神经元凋亡的因素： -淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激及神经生长因子分泌不足等,（三）病毒感染,由人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS，关键发病机制是CD4+淋巴细胞被选择性破坏，导致CD4+淋巴细胞减少，相关免疫功能缺陷。 凋亡在CD4+淋巴细胞减少中起到非常重要作用。,CD4+淋巴细胞减少机制：,1、HIV感染的CD4+淋巴细胞发生凋亡（1）形成合胞体或多核巨细胞，发生凋亡。（2）Fas基因表达上调，使细胞对Fas介导的凋亡敏感性提高。（3）HIV感染
24、时被激活的CD4+淋巴细胞不但不增殖，反而发生凋亡，称为激活诱导的细胞死亡。,2、未受HIV感染CD4+淋巴细胞发生凋亡（1）巨噬细胞受HIV感染后，分泌TNF增多，TNF可通过与受体结合启动死亡程序，也可刺激CD4+淋巴细胞产生大量氧自由基，通过氧化应激触发细胞凋亡。（2）受HIV感染细胞可产生tat蛋白，进入CD4+淋巴细胞，诱导细胞产生氧自由基。（3）受HIV感染细胞可表达gp120，与CD4+淋巴细胞上受体结合可促发CD4+淋巴细胞凋亡。（4）HIV慢性感染，受HIV感染的CD4+淋巴细胞可以作为效应细胞，作用于未感染的CD4+淋巴细胞，诱导凋亡。,三、细胞凋亡不足与过度并存,氧化型L
25、DL血小板激活Ag高血压 内皮细胞凋亡过度 平滑肌凋亡不足 动脉粥样硬化,已知的凋亡相关性疾病,第五节 细胞凋亡在疾病防治中的作用,合理利用凋亡相关因素干预凋亡信号转导调节凋亡相关基因调控凋亡相关的酶学机制,一、合理利用凋亡相关因素 凋亡诱导因素是凋亡的始动环节。 使用放疗、化疗（TNF）、高温、高热、神经生长因子或激素治疗凋亡相关 疾病。,二、干预凋亡信号转导 阿霉素刺激肿瘤细胞表达Fas/ FasL,导致肿瘤细胞间相互作用，引起凋亡。 免疫抑制剂环胞霉素A（cyclosporin A）可以阻止线粒体跨膜电位的下降，防治细胞凋亡。（N-methyl-Val-Cyclosporin）,三、调节
26、凋亡相关基因,将野生型P53基因导入P53基因发生突变的肿瘤细胞内，从而诱导肿瘤细胞凋亡。 Bcl2是凋亡抑制基因，有抑制细胞凋亡的作用。可设计基因封条（反义DNA），即：人工合成的与靶mRNA某些区段互补的DNA片断，结合形成DNA- mRNA杂交链，抑制或封闭相应基因的表达,四、控制凋亡相关的酶 核酸内切酶（钙离子、镁离子激活，锌离子抑制） Caspase在破坏细胞骨架蛋白方面起到重要作用，使用其抑制剂可减少心肌细胞凋亡，将该基因导入白血病细胞可促进凋亡。,电泳示意图,DNA片段化分析,细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。,
