1、TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124 大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53)检测试剂盒 使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围： 96T 78.13-5000pg/mL 灵敏度： 30pg/mL 使用目的： 本试剂盒用于测定大鼠血清样本 大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53） 含量 。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53） 水平。 用纯化的 大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53） 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 肿瘤蛋白p53(TP53， 再与 HRP 标记的 肿瘤蛋白 p53(TP
2、53） 抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 肿瘤蛋白 p53(TP53） 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值）， 通过标准曲线 计算样品 中 大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53）浓度。 试剂盒 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml 1 瓶 7 终止液 6ml 1 瓶 2 酶标试剂 6ml 1 瓶 8 标准 品 5000pg/mL 0.5ml 1 瓶 3 酶 标包被 板 12 孔 8 条 9 标准品 稀释液 1.5ml 1 瓶
3、4 样品 稀释液 6ml 1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml 1 瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml 1/瓶 12 密封袋 1 个 标本要求 1. 血清： 室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 2. 血浆： 应根据标本 的要求选择 EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。 尿液： 用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000
4、-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。 4.细胞培养上清： 检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。 5.培养细胞 : TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124 检测细胞内的成份时，用 PBS（ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓 度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀
5、形成，应再次离心。 6.组织标本 : 切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），或组织蛋白萃取试剂 , 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 7.标本采集后尽 早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20保存，但 应 避免反复冻融 8.不能检测含 NaN3 的 样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。 操作步骤 1. 标
6、准品：其浓度为 5000pg/mL(贮液 )。先将其稀释为 5000pg/mL 标准曲线最高浓度 )后，再准备 5 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 150 L 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释 5000pg/mL， 2500pg/mL， 1250pg/mL， 625pg/mL， 312pg/mL， 156pg/mL 品稀释液 （ 0pg/ml） 直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液 Tube 0 1 2 3 4 5 pg/mL 5000pg/mL 2500pg/mL 1250pg/mL 625pg/mL 312pg/mL 156pg/mL 1
7、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔 。在酶标包被板上标准品准确加样 50l， 待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于 酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻 晃动 混匀 。 1. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟 。 2. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 3. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 4. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外 。 5. 温育：操作同
8、3。 6. 洗涤：操作同 5。 7. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀， 37避光显色10 分钟 . 8. 终止：每孔加终止 液 50l，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。 9. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度（ OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结： TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124 计算 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以 稀释倍数 ；或用标准物的浓
9、度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以 稀释倍数 ，即为样品的实际浓度。 注意事项 1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。 3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后 乘以 总稀释倍数（ n 5）。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6底物请避光保存。 7严格按照说明书 的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124 9本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1 试剂盒保存： ； 2-8 。 2有效期： 6 个月
