1、1,酵母表达系统,优点1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化2 操作容易3 经济4 快速,2,酵母细胞结构,3,两种酵母表达系统,酿酒酵母表达系统Saccharomyces cerevisiae过去常用,毕赤酵母 Pichia pastoris现在多用,4,Pichia pastoris 表达系统,Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源.易操作,培养容易表达量高, 可达培养液中10 g/L可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化避免了酿酒酵母的过糖基化问题,5,6,1. Pichia pastoris 的表达载体,胞内表达载体,P. pastoris没有
2、稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体,7,Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子,AOX1是主要的酶受甲醇严格控制启动子用来驱动外源基因表达,AOX2利用甲醇的能力低生长慢,8,宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长；质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。,histidinol dehydrogenase gene (his4),9,2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR,10,胞内表达载体, pAO815,11,胞外表达载体, p
3、IC9K,12,pPIC9k, 胞外表达载体,13,3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝,因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低,未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低,14,pAO815 可体外构建多拷贝,15,BamH I：GGATCC CCTAGG,Bgl II：AGATCT TCTAGA,16,4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型,GS115AOX1正常，Mul+,KM71AOX1被破坏， MulS,宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长在表达质粒
4、转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长本身的回复突变为1/108。,17,转化后细胞的甲醇利用能力,GS115,KM71,AOX1正常，Mul+,AOX1被破坏， MulS,转化后对甲醇的利用,KM71无论在那里交换，只能是甲醇低利用，因为宿主没有AOX1,甲醇高利用Sal I 、 Stu I切,甲醇低利用Bgl II切,GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上交换的位置是否破坏宿主的AOX1,18,线性化位点,质粒线性化后转化宿主细胞,线性化质粒发生同源 重组的几率提高,19,pAO815和pPIC9K在Sal I 、Stu I 单切, 在his 4插入（单交换），不破坏宿主的AOX1，转化GS1
5、15后产生： His +/Mut+,单交换,同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。,20,pAO815和pPIC9K 在Bgl II双切： 在5AOX1位点和3AOX1双交换，替换掉了宿主的AOX1基因， 转化后GS115产生 His +/Muts,Bgl II,His4,5 AOX1,3AOX1,gene,His4,AOX1,21,22,技术路线,选择合适的内切酶位点将基因插入载体,注:pAO815和pIC9K是穿梭载体, 可在大肠杆菌中操作,pAO815体外构建多拷贝,转化宿主细
6、胞,线性化质粒,组氨酸缺陷平板筛选重组子,23,G418筛选pIC9K 多拷贝,PCR检测转化细胞中的基因插入,诱导表达SDS-PAGE检测,pAO815和pPIC9K,24,酵母菌转化,PEG 1000 Transformation Method for Pichia,Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2
7、M Bicine, pH 8.35Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35Filter sterilize and store at -20C.,25,制备感受态细胞,1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30C for two days.2. 挑菌落于 10 ml YPD 30C 摇过夜.3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30C to an OD600 of 0.5 to 0.8.4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，室温.5. 细胞
8、悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭菌的管中， 每管加 11 l DMSO（-70度） ，混匀，液氮快速冷冻， -70C保存。,26,保持感受态细胞在冰冻状态作转化！,Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. It is critical to add DNA to frozen cell samples. To perform multiple transformations, it is recommended to process t
9、hem in groups of six at a time.,27,Transformation,1. 10-50 g DNA（20 l液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 g of denatured and sonicated salmon sperm DNA）； 2. 37C 水浴5分钟， 中间混匀两次；3. 加 1.5 ml of Buffer B ， 彻底混匀；4. 30C水浴1 hour；5. 2000 x g 离心10 ， RT， 去上清，细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C中；6. 离心后将细胞悬浮在 0.
10、2 ml Buffer C中；7. 将细胞涂布在选择培养平板（MD）上， 30C for 3 to 4 days.,28,储存液,10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) ，抽滤；500X B (0.02% Biotin) ，抽滤；10X D (20% Dextrose葡萄糖 )，抽滤；10X M (5% Methanol)， 抽滤；10X GY (10% Glycerol)，高压；1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0， 高压。,29,YPD
11、培养基,Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)1% yeast extract2% peptone900 ml of water Autoclave for 20 minutes on liquid cycle.2% dextrose (glucose)， （20%储存液，抽滤灭菌）。Note: Add 20 g of agar if making YPD plates。,30,Minimal Dextrose MD平板,成分：1.34% YNB（yeast nitrogen base，酵母培养基） 4 x 10-5 % biotin 2
12、% dextrose配制方法：1. 800 ml 水， （平板加15 g agar），灭菌 20 ；2. 冷却到 60C ， 加100 ml of 10 X YNB，2 ml of 500 X biotin，100 ml of 10 X dextrose；3. 倒平板。,31,BMGY： Buffered Glycerol-complex MediumBMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter),成分：1% yeast extract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YN
13、B 4 x 10-5% biotin 1% glycerol （ BMGY ）or 0.5% methanol（ BMMY）,32,33,34,35,毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。2. 操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。,36,毕赤酵母系统的注意事项,严格无菌操作，防止污染；可以镜检温度30C;转化PCR检测5
14、. 诱导时间,37,酵母蛋白糖基化,酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型；然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多，但比人的大； 酿酒酵母核心寡糖有末端-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。,38,蛋白质糖基化,蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式 ；糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。,39,1、N-linked glycosylationa sugar attach to
15、 the amino group of an asparagine （天冬氨酰）. sequence motif Asn-Xaa-Ser/Thr,40,2、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue.,no sequence motif defined,41,3、C-Mannosylation （甘露糖化）sugar is linked to the protein through a carbon-carbon bond.,42,4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins. 糖基磷脂酰肌醇锚binding to the plasma membrane,
