呋喃妥因ADH酶联免疫分析ELISA.DOC

1、1 呋喃 妥 因 (ADH)酶联免疫 分 析（ ELISA） 试剂 盒 使用说明书 本试 剂 盒 仅 供 研 究 使 用。 1 使用目的： 本试剂盒用于检 测 动物组织（鸡、猪、牛 、 鱼、虾等 ） 、 牛 奶和蜂蜜中呋喃妥 因 (ADH) 残留 的 定 量 检 测 。 2 实验原理 本试 剂 盒 采 用 竞 争 ELISA 方 法 ， 在 微 孔 板 包 被有 呋喃 妥 因 (ADH)偶 联 抗 原 ，加 入 呋喃 妥因 (ADH)标 准 品或 样品 ，游离 呋 喃妥因 (AD H)与 微孔条 上 预包 被 的呋 喃妥 因 (ADH)偶 联 抗 原互 相 竞 争 抗 呋 喃 妥 因 (AD

2、H)抗 体 酶 标 记 物 ，用 TMB 底 物 显 色 ， 加 入 终 止 液 后颜 色 由 蓝 色 变为 黄 色 ， 用 酶 标 仪 在 450nm 波长下 进 行 检 测 ，吸 光值 与 样 品 中 呋 喃 妥 因 (AD H)含 量 成反 比， 通 过 标 准 曲 线 计 算 样 品中 呋 喃 妥 因 (ADH)的 含 量。 3 试剂盒组成 3.1 预 包 被 的 呋 喃 妥 因 (ADH)偶 联 抗 原 的 可 拆 酶 标板 ： 1 块 （ 12 孔 8 条 ） 。 3.2 呋 喃 妥 因 (ADH)标 准 品 ： 6 瓶 （ 1ml/瓶 ） ， 含 量 分别 是： 0 ppb， 0

3、.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。 3.3 抗 呋 喃 妥因 (ADH)抗 体 酶结 合 物 ： 1 瓶 （ 6ml） 。 3.4 显 色液 A： 1 瓶（ 6ml） 。 3.5 显 色液 B： 1 瓶 （ 6ml） 。 3.6 终 止 液 ： 1 瓶（ 6ml） ， 2M 硫 酸。 3.7 样 本 稀 释 液 ： 1 瓶（ 10, 6ml） ，用于 样 品 稀释 用。 3.8 浓 缩 洗 涤 液 ： 1 瓶（ 20， 20ml） ，用于 洗 板。 3.9 说 明 书 一 份 。 4 需要而未提供 的 材料 4.1 设 备 4.1.1波 长 450n

4、m酶标 仪 。 4.1.2粉 碎 机 。 4.1.3量 筒。 4.1.4振 荡 器 。 4.1.5漏 斗。 4.1.6Whatman No 1或 相当 的滤 纸 。 4.1.7微 量 移 液 器 。 4.2 试 剂 4.2.1去 离 子 水 或 蒸 馏 水。 4.2.2 甲 醇 。 5 贮存 5.1 试 剂 盒 贮 存 于 28， 切勿 冷 冻 5.2 未 用 完 的 微 孔 板 应 该 密封 干 燥 保 存 6 注意事项 6.1 使 用 试 剂 盒 前 请 仔 细 阅读 说 明 书 。 2 6.2 不 要 使 用 过 期 试 剂 盒 。 6.3 试 剂 盒 使 用 前 ， 将 试 剂恢 复

5、至 室 温 （ 252 ） ， 建议 至 少 回 温 2小 时 。 6.4 标 准 品 中 含 有 呋 喃 妥 因 (ADH)， 使 用 时 应 特 别 注意 ， 操 作 时 应 带 手 套。 6.5 终 止 液 中 含 有 硫 酸 ， 使用 时 防 止 灼 伤 皮 肤 及 腐 蚀衣 物 。 6.6 不 同 标 准 品 、 样 品 所 用吸 头 不 能 混 用 ， 否 则 会 影响 试 验 结 果。 6.7 不 同 批 号 试 剂 盒 中 的 试剂 不 得 混 用 ； 不 同 标 准 品 、 样 品 所 用 吸 头 不 得 混 用 ， 否 则 会 影响 实验 结 果。 6.8 稀 释 样 本

6、时 必 须 用 本 试剂 盒 中 的 样 本 稀 释 液 ， 否则 会 影 响 实 验 结果 6.9 混 合 试 剂 时 应 避 免 起 泡。 7 工作液准备 7.1 呋 喃 妥 因 (ADH)标 准 品 溶液 ： 0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb 7.2 浓 缩 洗 涤 液 ： 用 蒸 馏 水按 1:20(1+19)稀 释备用 7.3 样 本 稀 释 液 ： 用 蒸 馏 水按 1:10(1+9)稀 释 备用 7.3 显 色 剂 ： 已 备 用 ， 避 免光 线 直照 7.4 反 应 终 止 液 ： 已 备用 8 样品处理程 序 （样品在 提取

7、 过 程 中 ， 要 严 格 按说 明书 操作 ， 提 取 过 程 中应 准确 稀释 ， 否 则 会出 现 结 果 不 准 确 ， 样 品 应当 保 存 在 阴 凉 避 光 之 处 及冷 藏 保 存 ） 8.1取 10g粉 碎 的 样 品 ，加 20ml 70%甲醇 溶 液 8.2强 力 振 荡 3分 钟 8.3用 Whatman No 1滤 纸过 滤 8.4取 25l处 理 后 的 样 品 ， 加入 25l样 本 稀 释 液 于 反 应孔 中 （ 样 本 稀 释 倍 数 为 2） 9 酶免分析步骤 9.1 实 验 须 知 9.1.1 实 验 开 始 前 请 将 所有 试剂 于 盒 外 充 分

8、 恢 复 至 室 温（ 252 ） ， 时 间 约 2小 时。 回 温 至 室 温（ 252 ） 后 再 取 出 微 孔条 ， 多 余 的 微 孔 条 重 新 密封 立 即 于 28 干 燥 保存 注： 一 定 保证 回 温 充 分 ， 否则 影 响 检 测 的 精 确 度 和 准确 度 。 9.1.2 使 用 后 请 立 即 将 试剂 放回 28 保 存 9.1.3 请 不 要 改 变 分 析 程 序 9.1.4 请 使 用 精 确 的 微 量移 液器 9.1.5 操 作 一 旦 开 始 ， 请不 要中 断 任 何 程序 9.1.6 ELISA结 果 的 可 重 复 性极 大 程 度 的 取

9、 决 于 操 作 程序 ， 请 严 格 按 照 要 求 操 作 9.1.7 为 避 免 交 叉 污 染 ，每 个标 准 品 和 样 品 均 应 使 用 不同 的 吸 头 加样 9.1.8 加 样 时 请 勿 让 吸 头接 触微 孔 中 的 溶 液 或 内 表面 9.2 分 析 步 骤 9.2.1 预 先 进 行 编 号 ， 标记 B0、 标 准 品 和 样 品 的 位置 ，推 荐 进 行 双 孔 检测 9.2.2 取 所 需 数 量 的 微 孔（ 微孔 条 可 拆 ） ， 将 多 余 板条 重新 密 封 并 立 即 放 回 28 保存 9.2.3 样 品 稀 释 液（ 10） 、 浓缩 洗 涤

10、 液 （ 20） 稀 释 成 工作液 (蒸 馏 水 或 去 离 子 水 稀释 ) 9.2.4 在 B0孔 中 加 入 50l0.0 ng/ ml标准品 溶 液 9.2.5 在 各 标 准 孔 中 加入 50l的标 准 品 溶 液 9.2.6 在 各 样 品 孔 中 加入 50l样 品 溶液 9.2.7 在 所 有 孔 中 加 入 50l的抗 呋 喃 妥 因 (ADH)抗 体 酶结 合 物 9.2.8 轻 轻 晃 动 反 应 板 几秒 钟。 9.3 37 温 浴 30min （ 温浴 过程 中 不 时 轻 拍 反 应 板 ， 可以 减 少 双 孔 误 差） 9.3.1 甩 掉 孔 中 液体 ，

11、用 洗 液洗 涤 微 孔 板 5次 ， 最 后 一 次应 在 吸 水 纸 上 拍 打 以 完 全除 去 孔 中 液 3 体。 9.4 反 应 9.4.1 洗 涤 程序完成 后 ， 立 即用微量移液 器 在每个 微 孔中先加入 50l显色 液 A， 再加 50l显 色 液 B； 轻 微 晃 动 反 应 板 使 之彻 底 混匀 9.4.2 37 温浴 10min 9.4.3 每 孔 中 加 入 50l终 止 液， 混 匀 9.4.4 在 450nm下检 测 吸 光 度， 结 果 在 5min内读 取 。 10 结果计算 10.1定 量 分 析 10.1.1所 获 得 的 每 个 浓 度标 准溶 液

12、 和 样 本 吸 光 度 值 的 平均 值 （ B） 除 以 第 一 个 标 准（ 0标 准 ） 的吸 光 度 值（ B0） 再 乘 以 100%， 即 百 分 吸 光 度 值。 B 标 准 溶 液 或 样 本 溶 液 的 平均 吸 光 度值 B0 0g/L标准 溶 液 的 平 均 吸光 度 值 10.1.2以 呋 喃 妥 因 (ADH)浓 度的 对 数 值为 X轴 ， 百 分吸 光度 值为 Y轴 ， 绘 制 标 准曲 线图 。 根据 样品 百 分 吸 光 度 值 ， 可 从 曲线 上 得 到 对 应 点 的 横 坐 标， 即 为 呋 喃 妥 因 (ADH)浓度 的 对 数 值， 求得 反 对

13、 数 即 为 测 定 液 中 呋喃 妥 因 (ADH)浓 度 C（ ppb） 10.1.3由 于 样 品经 过 了预 先 稀释， 因 此 根 据标 准 曲 线 所得出 的 样 品 浓度 一 定 要 再乘以 其 稀释 倍数。 10.2 半 定 量 测 定 10.1.1目 测 半 定量 测 定： 首 先选择 一 个 适 当的 标 准 液 与样品 同 运 行 ，根 据 样 品 与标准 品 吸光 度值 的 高 低 比 较 ， 判 断 样 品浓 度 值 是 小 于 还 是 大 于 标准 值 。 10.1.2仪 器 半 定量 测 定： 首 先选择 一 个 适 当的 标 准 液 与样品 同 运 行 ，根 据

14、 样 品 与标准 品 颜色 深浅 比 较 ， 判 断 样 品 浓 度 值是 小 于 还 是 大 于 标 准 值 。 11 特异性 物质 交 叉 反应 呋喃 妥 因 代 谢物 100 呋喃 唑 酮 代 谢物 小 于 0.1 呋喃 它 酮 代 谢物 小 于 0.1 硝基 糠 腙 （ 呋喃 西 林 ） 代 谢物 小 于 0.1 呋喃 唑酮 小 于 1 呋喃 它酮 小 于 1 呋喃 妥因 13 呋喃 西林 小 于 1 12 试剂盒参数 本试 剂 盒 检测 下 限 为 0.05ppb B0吸 光 度最 佳 值 应 大 于 1.0 试剂 盒 吸 光 度 板 内 误 差 小 于 8 ， 板 间 误 差 小 于 15 。 用本 说 明 书 提 供 的 组 织 样 本提 取 方 法 回 收 率 大 于 80。 13 标准曲线模式（仅供 参 考） 试 剂 盒 提 供 的 标 准 曲 线 范 围 为 0.1ppb8.1ppb 。