1、第五章: Amino Acids, Peptides, and Protein,Peptide (約小於50個胺基酸聚合成的分子) Protein (較長的polypeptide)蛋白質是胺基酸聚合成的複雜巨分子之總稱。這些巨分子是由20種不同的胺基酸聚合組成，蛋白質的特性會依胺基酸聚合排列不同而變化。,胺基酸(amino acid):,蛋白質水解後變成它們的聚合單體分子稱胺基酸 每個胺基酸同時具有羧酸基 - COOH與胺基- NH2，而R基則是每個胺基酸的特性區域。,圖5.3 -胺基酸的一般結構,胺基酸的分類:,1非極性的中性胺基酸: 中性的意思是R 基(group)在生理的pH時並不帶正或
2、負電荷。這類胺基酸的R group(原子團)是帶疏水性基(hydrophobic group)。,圖5.2 標準胺基酸,色胺酸與酪胺酸（苯丙胺酸則較差）會吸收紫外光（圖3-6），這也是蛋白質在波長 280 nm 附近會有強吸光之成因。圖3-6 為比較芳香族胺基酸色胺酸與酪胺酸在 pH 6.0 時之吸收光譜，發現兩者在相等莫耳濃度之下（10-3 M），色胺酸之吸光值為酪胺酸的4倍；兩者之最大吸收波長則均接近 280 nm。另一種圖中未標示的芳香族胺基酸苯丙胺酸吸光值甚低，通常對蛋白質的光譜性質無貢獻。,continued,圖 3-6 芳香族胺基酸可吸收紫外光。,2 極性的中性胺基酸: R gro
3、up的組成是具親水性的分子。如hydroxyl group(-OH)羥基、amide(-CONH2)醯胺基。,圖5.2 標準胺基酸,3 酸性的胺基酸: 兩個標準的胺基酸其R group在生理濃度下帶有負電荷。如aspartic acid 、glutamic acid在生理濃度下asparate與glutamate。,4 鹼性胺基酸: 在生理pH值下，鹼性胺基酸帶正電荷。如lysine、arginine、histidine。Histidine在生理濃度時是一個弱鹼(因在pH =7時只有部分解離)，在許多具催化活性的酵素中扮演重要的角色。,酸性或鹼性胺基酸,表 3-1 組成蛋白質的各種常見胺基酸之
4、基本性質,胺基酸具特有之滴定曲線,圖3-10 為雙質子態甘胺酸的滴定曲線，此圖形具有兩個特別顯著的階段，對應於甘胺酸上兩個不同基團的去質子化過程。圖3-10 為 0.1 M 甘胺酸在 25 時之滴定曲線。滴定過程中各階段重要之離子化物種如圖上方所示。陰影區以 pK1 = 2.34 與 pK2 = 9.60 為中心，顯示這些區域之 pH 值具有最大的緩衝能力。,continued,圖 3-10 胺基酸之滴定。,圖 3-12,胺基酸的立體異構物:,胺基酸的碳接了4個不同的基或原子(H、-COOH、NH2與R)，這個碳稱不對稱碳或對掌碳(chiral carbon)。分子內有一個原子像碳特性者，則會
5、產生光學異構物(enatiomers)，這個原子會形成稱對掌中心(chiral center)。這種空間排列不同所造成的異構物稱立體異構物(stereoisomer)。,圖5.8 兩個鏡像異構物,圖5.9 D-及L-甘油醛,胺基酸的反應:,有兩種胺基酸的反應，因為鍵結上的效應特別引人興趣。1.Peptide bond的形成: Polypeptide是由Peptide bonds連結而成。peptide bond中的醯胺連結(amide linkage)是胺基酸上的未配位的電子對攻擊另一個胺基酸上的-carboxyl上的碳， 然後脫去水形成peptide bond。,圖5.11 二元胜肽的形成,
6、圖5.11 二元胜肽的形成,圖5.13 多胜肽鏈,Peptide 的表示法: H2N-Tyr-Ala-Cys-Gly-COOHPeptide中第一個胺基酸具有一個自由的胺基(amino group)，又稱N-terminal(N-端)，最後一個胺基酸具有一個自由的羧基(carboxyl group)稱C-terminal(C-端)。,2.Cysteine oxidation: cysteine上的-SH基相當活潑，這些-SH基可以相互形成氧化狀況的雙硫鍵(disulfide bond或disulfide bridge) 。這種雙硫鍵發生在單鏈的蛋白內，也發生在2個或多個蛋白鏈的分子間之接合，形
7、成分子間的橋樑。disulfide bridge有助於穩定許多蛋白結構。,圖5.14 兩分子半胱胺酸氧化形成胱胺酸,Peptide:,有許多peptide具有生理活性 例如:三個胺基酸組成的Tripeptide: glutathione(-glutamyl-L-cysteinylglycine) 。幾乎存於各種生物體，參與許多重要的生理功能。,Glutathione的生理功能,DNA與一些生物分子的合成藥物與環境毒物的代謝胺基酸的輸送。 充當有效的還原劑(被氧化),催產素(Oxytocin)在分娩時會剌激子宮肌肉的收縮，哺乳時能促進乳汁的分泌血管增壓素(vasopressin)是抗利尿激素(a
8、ntidiuretic hormone)，在血壓低與高血鈉濃度被分泌出來，可助腎臟留住水分 Met-enkephalin與leu-enkephalin屬於鴉片peptide(opioid peptides)，能緩解痛產生興奮的感覺。,心房利鈉因子:剌激稀尿的產生，與血管加壓素具相反效果。NPY與galanin:抑制食慾的peptides。物質P與緩動素:剌激痛覺，與鴉片類peptides具相反的作用。,5.2 胜肽,蛋白質歸納至少有以下的功能,1 催化(catalysis):酵素幾乎全是蛋白質。2 結構(structure):龜甲、蜘蛛絲、指甲與頭髮等。3 移動(movement):tubul
9、in、actin等。4 防衛(defense):蛇毒、蜂毒與抗體等。5 調節(regulation):胰島素、升糖激素等。,6 輸送(transport):離子通道、萄葡糖輸送蛋白與脂蛋白等。7儲存: 酪蛋白、卵清蛋白等。8壓力反應: 熱休克蛋白、金屬硫蛋白等。,蛋白質的型態可區分兩類:,1 fibrous protein:長、棒狀分子，不溶於水。如皮膚、頭髮、指甲等具有結構與阻隔的功能。2 Globular protein:組成緻密的球狀分子，通常是可溶的。,依據組成的特性又可區分成簡單(simple)或共軛蛋白(conjugated protein)。1 simple protein:蛋白
10、內僅含有胺基酸，如血清中的白蛋白(serum albumin)。2 conjugated protein:據有簡單的蛋白加上一些非蛋白的組成，這些非蛋白組成稱prothetic group。,蛋白質結構上的訊息分為數種層次,1 一級結構(primary structure):胺基酸序列(amino acid sequence)，是基因訊息的表現。2 二級結構(polypeptide chain)折疊(folding)完成時，相臨的胺基酸會形成特殊結構。,3 三級結構:當polypeptide的三度空間的結構。4 四級結構:由二個或多個polypeptide chain或稱次單元(subunit
11、)組合成的蛋白質。,一級結構:,每一個polypeptide皆有一個特異的胺基酸序列(amino acid sequence)。序列內的胺基酸彼此的作用，決定了蛋白三度空間的結構。Polypeptide間具有相似的胺基酸序列與功能者稱homologous，比較物種間某些polypeptide的胺基酸序列的相似性。即能找出物種間的遺傳關係。,例如粒線體內的cytochrome c蛋白。 各個物種中，這個蛋白(cytochrome c)的胺基酸序列相同的區域稱不變區(invariant)，可能是蛋白功能必需的序列。而(Variant)變異區之胺基酸結構的改變不會影響polypeptide的功能。,
12、Conservative substitution(保留型取代):胺基酸取代成支鏈特性相似者(功能類似的胺基酸)，這種取代不致影響到蛋白質的功能。conservative與variable這些取代(substitutions)位置常用來追蹤進化關係。,GDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRRTGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRRTGDVFKGKRIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRRTGDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRRTGSAKKGATLFKTRC
13、LQCHTVEXGGPHKVGPNLHGIFGRHSGDVAKGEAAFKR-CSACHAIGESAKNKVGPQLNGIIGRTA1 Human, 2 Chimpanzee, 3 Spider monkey, 4 Zebra, 5 Yeast, 6 AgrobacteriumCytochrome C(about 85 a.a.),鐮刀型性貧血症,鐮刀型性貧血導因於血紅蛋白(hemoglobin)的突變，這是血紅蛋白-chain的次單元蛋白中第六個胺酸產生突變造成的，由疏水性的Valine取代帶負電荷Glutamic acid，造成血紅蛋白與氧的結合力降低，血紅蛋白在缺氧時聚集成棒狀結構。,此
14、時病人的紅血球變成鐮刀型，易造成溶血(hemolysis)導致嚴重的貧血。Sickled cells造成的微血間歇性阻塞常導致組織缺氧。Sickle-cell anemia的特性就是極痛苦、器官損害與早期死亡。,圖5.17 HbA及HbS中-鏈的部分,二級結構,polypeptide的二級結構是由數種重複的結構組成。最常見到的二級結構是-helix與-pleated sheet。這是組成polypeptide的胺基酸間的氫鍵造成的，而氫鍵是由胺基酸的-NH與-C=O基形成，許多纖維蛋白質幾乎是由蛋白的二級結構組成。,-helix:,是一個硬且棒狀的結構。由一條polypeptide chain
15、 以右旋方式纏繞成的結構。一個胺基與距離4個胺基酸遠的C=O基作用形成氫鍵。3.6個胺基酸一轉，每一轉有54 nm，胺基酸的R基則伸向外面。,有一些胺基酸的R基較特殊不易形成-helix。如Glu、Asp與Tryptophan，另外proline因為缺乏自由的胺基，也是屬於抑制-helix的胺基酸。,圖5.18 -螺旋,-pleated sheets(摺板),兩個或更多個polypeptide chain一列一列的對齊，-pleated sheets是靠分子間的氫鍵來穩定，相鄰polypeptides的胺基與C=O形成對應的雙鍵。-pleated sheets分成兩類:1平行式: polype
16、ptide chain排同一方向2 反平行式: polypeptide chain排列方向相反，即一條是N至C，相鄰一條是C至N。,圖5.19 -摺板,圖5.19 -摺板,圖5.20 選擇的二級結構,三級結構:,球蛋白內也可能含有二級結構，三級結構是三度空間的構形，也可以認為絕大部分一級結構中胺基酸的支鍵(side chain)整體交互作用的結果。,圖 4-1 胰凝乳蛋白(酶)（一種球狀蛋白質）之結 構。,圖5.16 酵素腺苷酸激酶,圖5.16 酵素腺苷酸激酶,穩定三級結構的交互作用:,1疏水性的交互作用(hydrophobic interactions): 2靜電作用力: 3氫鍵: 4共價鍵
17、:在蛋白合成時或合成後會形成共價鍵連結來改變polypeptide上的三級結構。影響三級結構最顯著的共價鍵為雙硫鍵(disulfide bridges)。,圖5.22 主要的三級結構之交互作用力,四級結構:,許多蛋白質是由數個polypeptide chains 組成，每一個polypeptide稱次單元(subunit)。 次單元間的作用常常受到一些結合的配位基(ligand)影響，在異化作用(allostery)中，經由配位基的結合可以控制蛋白的功能。,一個配位基結合至蛋白一個特異的位置會啟動蛋白構形的改變，這種作用稱allosteric transitions。引起此種作用的配位基稱ef
18、fectors或modulators。,圖5.31 血紅素,變性(denaturation):,蛋白結構周遭的影響特別敏感，許多物理與化學試劑會破壞蛋白原來的構型，蛋白質的結構破壞稱denaturation(通常不涉及peptide bond的破壞)。,變性的環境如下:,1強酸或強鹼2有機溶劑3清潔劑:4還原劑: 5鹽濃度: 6重金屬:7溫度改變:8機械壓力:攪拌、研磨均可破壞蛋白結構。,圖5.24 Anfinsen實驗,纖維蛋白(Fibrous protein):,纖維蛋白富含規則的二級結構(如-helix、-pleated sheets，造成他們的形狀似狀或片狀。例如-keratin、co
19、llagen與silk fibroin。,-keratin:,纖維蛋白中，一束束螺旋形的polypeptide被絞成一大束。如頭髮、羊毛、皮膚、角與指甲等皆是一種-keratin的蛋白質。 這種具規則的-helix是因為它們缺乏破壞螺旋的胺基酸如proline，但富含促成螺旋胺基酸如alanine、leucine。 而頭髮的捲曲程度，角與指甲的硬度則是以-keratin內含雙硫鍵的程度決定。,圖5.25 角蛋白,膠原蛋白(Collagen):,脊椎動物最豐富的蛋白，是由聯接組織的細胞所合成，然後再分泌至胞外。膠原蛋白是由三個左旋的polypeptide彼此絞成大束的右旋的纖維。 主要分於牙、骨
20、、皮膚與肌鍵。膠原蛋的胺基酸組較特殊，Glycine約佔胺基酸組成的1/3，proline與 4-hydroxylproline約佔30%的胺基酸組成。Gly-X-Y重複的胺基酸排列順序。X常為proline與4-hydroxylproline，Y有時是hydroxylproline。,圖5.26 膠原蛋白,Silk fibroin:,數種昆蟲與蜘蛛會吐絲，這種絲是-keratin的蛋白纖維組成，polypeptide chains是反向的-pleated sheets結構。 絲具有強的彈性，這是因為-pleated sheets結構中，polypeptide chains分子與分子彼此間結合
21、力不強，很容易滑動，此種特性使得絲織品很容彎曲。,圖5.27 絲蛋白的分子模型,球蛋白(Globular protein),與氧結合的肌紅蛋白(myoglobin)與血紅蛋白(hemoglobin)是球蛋白研究的好範例。 兩個蛋白皆是hemoprotein，能結合heme。能結合氧分子且具可逆性，但兩個蛋白的生理角色不大一樣。,圖5.29 肌紅蛋白,圖5.28 血基質,Bohr effect(波爾效應):,氧氣輸送到組織的機制:在組織細胞中，二氧化碳擴散至血液形成HCO3-與H+，pH值下降，使得H+附在hemoglobin的一些胺基酸的R基上，同時CO2也會結合至一些未帶電荷的胺基酸，增加d
22、eoxyHb結構的穩定，增加氧的釋放。,圖5.30 血基質的氧結合位由一個摺疊的球蛋白所形成,圖5.31 血紅素,圖5.32(a)氧化血紅素的三維立體結構,圖5.32(b)去氧化血紅素的三維立體結構,圖5.33 血紅素異位轉移,2,3, Bisphosphoglycerate(BPG)在調節hemoglobin的功能上扮演重要的角色。缺乏BPG時，hemoglobin對氧有非常高的親合力，當H+與CO2增加時BPG結合hemoglobin有助於穩定去氧的hemoglobin(deoxyHb)。,圖5.34 測量血紅素和肌紅素與氧的親和力之平衡曲線,圖5.35 2,3-二磷三甘油酸(2,3-bi
23、sphosphoglycerate)(BPG)對於氧與血紅素間親和力的影響,在肺部情形正好相反，高濃度的氧與hemoglobin趨使deoxyHb 成oxyHb，導致H+、CO2與BPG從oxyHb釋出。H+與HCO3-結合形成carbonic acid(H2CO3)，然後分離成CO2與H2O釋出。,蛋白質毒物,霍亂：簡介歷史生化恐怖主義及炭疽熱,圖5.A 霍亂毒素的 B-次單位,蛋白質技術,分離技術管柱層析(column chromatography)1分子篩層析法(gel filtration)2離子交換層析法(ion exchanger)3 HPLC4親和性管柱,圖5.C 膠體過濾管柱層
24、析,圖5.D 利用膠體過濾管柱層析來測定分子量,胺基酸的定序,N端定序法:又稱Sanger method此法是利用Edman reagent降解N端最後一個胺基酸，再利用HPLC的技術決定分解出的胺基酸。,SDS-PAGE電泳,分離蛋白質最常用的電法技術如果想知原理請至實驗室,圖5.E 膠體電泳,X-ray繞射,解出蛋白質固態3D結構的唯一方法。,圖5.F X-射線結晶法概要圖,Methods for determining the three-dimensional structure of a protein,X-ray diffraction,Globular proteins of tertiary have a variety structures,Heme,
