1、第四章：抗生素效价的微生物检定法,授课人:汪穗福(高级讲师) 苏惠虹(助理讲师) 广州市医药中专学校,教学目标： .解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、 了解抗生素的主要作用机制 .叙述抗生素的效价和单位及其表示方法 .熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求 .述说测定原理。,教学重点： 抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求,教学难点：抗生素效价检定操作方法二剂量法效价计算公式抗生素的主要作用机制,第一节 概述第二节 抗生素的效价和单位第三节 管碟法测定操作第四节 二剂量法总结及作业,第一节 概述 一、抗生素的主要作用机制 、抑制细胞壁
2、的合成 、影响细胞膜的功能 、干扰蛋白质的合成 、抑制核酸的合成 二、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天然有机化合物。 三、医药用抗生素的特点： (1)有较大的差异毒力 ：差异毒力越强，越有利于临床应用。 (2)抗菌活性强：MIC值越小，表示活性越强。 (3)抗菌谱广：广谱抗生素、窄谱抗生素 (4)不产生副作用和不良反应,四、抗生素效价微生物测定技术 （一）概述 效价测定技术方法： 1、物理、化学法：简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用 2、微生物法：原理和临床应用的要求相一致，直接反
3、映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量较小，因此被广泛使用。,微生物法： 依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的比浊法；有依据抗生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法(又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法)；根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产生影响的脱氢法。 浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方法。 管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼
4、脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比。,（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈： 将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生素分子扩散到一定时间，在小钢管周围形成一个能有效的抑制试验
5、菌生长的范围，也就是通常所说的抑菌圈。,2、影响抑菌圈大小的因素： 抑菌圈的半径(大小)与最小抑菌浓度C，琼脂层厚度H，抗生素在琼脂内扩散系数D，抗生素在小钢管中的量M，以及抗生素的扩散时间T有关：这些因素的改变，常会影响抑菌圈的大小和清晰度。,按设计原理不同分:,管碟法,一剂量法（标准曲线法）,二剂量法（22法）,三剂量法（33法）,日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。,3、管碟法常用的三种方法：,第二节 抗生素的效价和单位,一、抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。 效价（otency）：指检品的实际单位数与其
6、标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。 单位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分的具体尺度。,二、抗生素的效价单位的表示方法,、质量单位 以抗生素的生物活性部分质量作单位，微克（）单位，毫克单位。,、类似质量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克个单位。,、质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。,、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。,复习旧课:,1、抗生素是指主要由_生成的_一类_化合物称之。2、作为医疗用抗生素应具有、特点。3、抗生素
7、效价的微生物检定法常用、方法进行。4、表示抗生素的效价和单位有、等方法。5、中国药典规定的应用方法中22法中第1个与第2个2是分别表示，而两个2则是分别表示意思。,教学目标： 熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求教学重点： 抗生素效价检定操作方法与基本要求教学难点： 抗生素效价检定操作方法,第三节 管碟法测定操作,第三节 管碟法测定操作,1. 试验用菌液、缓冲液、培养基的制备 按药 典规定进行制备。,2. 标准品与供试品溶液的制备 按药典规定制备标准品与供试品高低不同浓度溶液。,3. 双碟的制备 制备底层(每个培养皿20ML)及含一定量试验菌的菌层(每个培养皿5ML)，并安置小钢管。,4. 滴
8、加药液到小钢管内 将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。,5. 培养 在恒温培养箱中培养至规定时间。（注意更换成瓦盖）,6. 测量抑菌圈 可用手工测量或仪器测量。,7. 计算结果 先进行可靠性测验,符合规定,再进行效价计算,抗生素效价检定管碟法操作流程:,二、影响因素的控制 1直线斜率的控制 2直线截距的控制 3抑菌圈大小的控制 4培养基的厚度 5. 剂量反应直线范围控制 6. 抑菌圈圆整及清晰度的控制,三、抗生素操作要求,（1）防止抗生素污染（2）操作次数序安排上的误差 （3）测量抑菌圈应避免误差,教学总结：抗生素效价检定管碟法操作流程,抗生素效价检定管碟法操作流程:,布置作业： P92
9、综合测验题 一、填空题 7、8 二、填图题,第四节 二剂量法,二剂量法的原理与测定方法： 该法系将抗生素的标准及检品各稀释成一定比例(2:1或4:1)的二种剂量，即高剂量和低剂量。在同一培养基平皿上进行对比，根据它们所产生的抑菌圈大小计算检品的效价。,一、效价计算公式 二剂量法效价计算公式经推导可得出供试品的效价计算公式。 V=T1 +T2 S1 S2 （43） W=T2 T1 + S2 S1 （44） LgR=(W/V).I （45） R=lg1(W/V).I （46） pT =AT.R （47） Lg=(V/W).I （48） =lg-1.(V/W).I （49）,二、操作方法基本要点：
10、高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在2024 mm，个别抗生素的抑菌圈可在1824 mm； 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可较小； 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之比为4:1的比率。,操作步骤： 1. 称量 2. 稀释 3. 双碟的制备 4. 放置钢管 5. 滴加抗生素溶液 6. 抑菌圈测量,图46：钢管放置器（北京先驱威锋技术开发公司生产开发）,教学总结： 抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的主要作用机制。 布置作业： P91-92 综合测验题,标准品的称量,标准品,返回,试验用菌液、缓冲液、培养基、 标准品与供试品溶液的制备,制备过程,返回,抽提,加入乙醚进行抽提,共抽提三次(取其下层),返回,双碟的制备,制备底层,制备菌层,放置小钢管,返回,滴加药液到小钢管内,返回,在恒温培养箱中培养至规定时间 （盖上陶瓷盖）,返回,测量抑菌圈,测量过程（活动）,方法一,测量仪器,方法二,测量过程（活动）,返回,计算结果,返回,
