1、分子生物学基本技术,讲授内容,一、分子杂交与印记技术二、PCR技术三、基因文库四、DNA测序技术五、芯片技术六、蛋白质相互作用研究,一、分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,一、基本原理,（一）印迹技术（二）探针技术,探针 (probe) 一
2、小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,三种印迹技术的比较,放射自显影照片,其他杂交技术：斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)
3、DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip),斑点杂交（dot blotting）,将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。,反向斑点杂交（reverse dot blotting）,先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。,13,原位分子杂交技术,原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表
4、达产物的定位分析。,荧光原位杂交（FISH）,DNA点阵,二、聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本原理,模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,二、PCR体系基本组成成分,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,四、PCR的主要用途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时
5、PCR技术,实时PCR技术原理,三、基 因 文 库 Gene Library,基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,四、DNA序列测定分析 Nucleic Acid Sequence Analysis,一、DNA链末端合成终止法,二、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sange
6、r测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,五、芯片分析技术,Biological Chip Technology,DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),
