1、第1章 组织学绪论,Epithelial Tissue,苏衍萍,泰山医学院基础医学院组织胚胎学教研室,是医学课程中的基础学科，是研究人体细微结构及其机能关系的一门科学。组织由细胞和细胞外基质（extracellular matrix）构成。按照结构和功能不同通常把机体的基本组织分为四种，即上皮组织、结缔组织、肌组织、神经组织。,一、组织学的研究内容,1.组织学（Histology）,2.组织学研究内容,亚细胞和分子,问题 解决方法 观察对象太小 放大 显微镜 观察对象无色，无反差 染色（HE染色） 观察对象生化成分不同 细胞化学、免疫组织化学 观察对象是活体 培养,二、组织学研究方法和技术,（
2、一）普通光学显微镜技术,HE染色：苏木精（Hematoxylin）伊红（Eosin）染色,碱性染料,将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色,酸性染料,将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色,细胞核中的DNA、RNA细胞质中的RNA,细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）,嗜碱性（basophilia）：对碱性染料亲和力强的物质。嗜酸性（acidophilia）：对酸性染料亲和力强的物质。中性（neutrophilia）：为对碱性染料和酸性染料亲和力都不强的物质（图1-1）。 当用硝酸银染色时，有些组织结构可直接使银离子还原为银颗粒而成黑色，称为亲银性（argentaffin）,有些组织加入还原剂才
3、能显色，称为嗜银性（argro philia）（图1-2）,（二）特殊光学显微镜,荧光显微镜技术 荧光显微镜（fluorescence microscope）以紫外线为光源，激发细胞、组织内的荧光物质或者荧光染料发出荧光。适用于观察细胞和组织内各种自发荧光物质，也可以观察被荧光素或者荧光染料标记的细胞、组织结构。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein-isothio-cyanate, FITC）、碘化丙啶（propidium iodide, PI）（图1-3）等,2. 相差显微镜技术,相差显微镜（phase contrast microscope）适用于观察体外培养中活细胞的形态
4、结构。相差显微镜可将活细胞内各种结构对光产生的不同折射（相位差）转换为明暗差别（振幅差），从而使观察对象结构反差明显。这种显微镜常将光源安装在载物台上面，物镜在载物台下面，称倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope），可观察生长在培养皿（瓶）中的活细胞（图1-4），并进行摄片及录像以记录活细胞的增殖、分裂和运动等行为。,3.激光扫面共聚焦扫描显微镜,激光扫描共聚焦扫描显微镜（laster scanning confocal microscope, LSCM），是以激光束通过扫描器和柱状透镜到达物镜，聚焦后对样品不同深度进行扫描，再经过光电信号转换在显
5、示屏上，图像同时传送到计算机图像分析系统，对图像进行二维或三维的分析处理。可以检测、识别组织或细胞内微细结构及其变化、细胞的受体移动、膜电位变化、酶活性以及物质转运，并以激光对细胞及染色体进行切割、分离、筛选和克隆，实现亚细胞和分子水平的结构与功能研究。,（三）电子显微镜技术,1透射电子显微镜技术 透射电镜（transmission electron microscope,TEM）是通过电子枪发射的电子束穿透观察样品后，经电磁场的聚合放大并在荧光屏上显像，或将影像投射到照相底片上。由于电子束的穿透能力较弱，故样品的厚度以不超过100 nm为宜，一般是5080nm，称超薄切片。,电镜下所看到的结
6、构通常称超微结构。 细胞内重金属盐沉积的部位因电子多被散射而较少投射到荧光屏上，故呈较黑暗的图像，称电子密度高（electron-dense）；反之图像则较明亮，称电子密度低（electron-lucent）（图1-5）。,2扫描电子显微镜技术,扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）主要用于观察细胞、组织和器官表面微细结构。特点是图像富有三维立体感，如细胞的微绒毛、纤毛等。其分辨率为610 nm。组织经戊二醛和锇酸固定、脱水和临界点干燥后，在其表面喷薄层碳和金属膜。扫描电镜发射的极细的电子束（电子探针）在样品表面扫描，将样品表面产生的二次电子用探测器收集，
7、形成电信号送达荧光屏上显像。形成的图像清晰，立体感强（图1-6）。,（四）组织化学与细胞化学术,组织化学（histochemistry）与细胞化学（cytochemistry）技术是利用化学试剂与组织、细胞内某种待检化学成分发生化学反应，在局部形成有色沉淀物，便于在光镜或电镜下对其进行定位、定性甚至定量研究。,1. 糖类显示法,最常用的显示多糖或蛋白多糖的方法是过碘酸-希夫反应（periodic acid-Schiff reaction），简称PAS反应。其原理是：过碘酸是一种强氧化剂，可将多糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基；后者再与Schiff试剂中的亚硫酸品红结合，形成不溶于水的紫红色沉淀
8、，紫红色物质存在的部位即是多糖和糖蛋白存在的部位。基底膜、系膜基质、纤维蛋白、血管透明变性、淀粉样物质等可显示阳性反应，呈紫红色（图1-7）。,2. 酶类显示法,酶对其相应底物水解、氧化而产生的反应物与捕获剂发生反应时，可形成有颜色的最终产物。且以最终产物显色的深浅程度来判断酶活性的有无与强弱。不同的酶有不同显示方法。例如，酸性磷酸酶催化底物-甘油磷酸钠水解产生磷酸根，然后以Pb2+捕获磷酸根，生成无色、电子致密的磷酸铅沉淀，可在电镜下观察。如再用硫化铵与磷酸铅反应，形成黑色硫化铅沉淀，就可在光镜下观察。,3. 脂类显示法,组织块可用甲醛固定，冷冻切片。用油红O、尼罗蓝、苏丹类脂溶性染料（如苏
9、丹III、苏丹黑B）染色，使脂类（脂肪、类脂）呈相应染料的颜色（图1-8）。亦可用锇酸固定兼染色，脂肪酸或胆碱可使四氧化锇还原为二氧化锇而呈现黑色。,4. 核酸显示法,显示DNA常用福尔根反应（Feulgen reaction）：切片经稀盐酸处理，使DNA水解、醛基暴露，继而用Schiff试剂试剂处理，形成紫红色反应产物。同时显示DNA和RNA可用甲基绿-派若宁反应：甲基绿与细胞核内的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁以及胞质内的RNA结合呈红色。,（五）免疫组织化学与免疫细胞化学技术,主要是利用抗原与抗体特异性结合的原理，应用已标记的特异性抗体，与组织、细胞内的特异性抗原结合，检测组织、细胞中
10、抗原性物质（蛋白质和多肽等）存在和分布的一种技术，称免疫组织化学（immunohistochemistry）和免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。免疫细胞化学染色的基本方法分直接法和间接法(图1-9, 图1-10 ) 。 常用标记物有辣根过氧化物酶(图1-11)、碱性磷酸酶和荧光素等。,（六）原位杂交术,原位杂交的原理是根据碱基互补的原则，用一段已知的碱基序列，经特定标记，制成带有特定标记的核酸探针，与组织、细胞内待测的DNA片段或者mRNA进行杂交。并通过标记物的显示，可在光镜、电镜下观察待测核酸的存在和分布。探针标记物有两类：放射性同位素（如3H、35S、32P、1
11、4C、125I等），经放射自显影术处理后观察；非放射性物质（如地高辛、生物素、荧光素、铁蛋白等），经免疫组织化学技术处理后观察。,（七）体外培养,体外培养技术（in vitro culture)用于研究细胞、组织的生物学行为，如细胞增殖、分化、代谢、运动、分泌、融合等，也可以用于观察物理、化学以及生物因素对其生物学行为的影响（图1-4）。目前，主要利用机械或酶消化法分离和纯化组织中的某种细胞，制成单细胞悬液，然后将细胞接种于培养瓶或培养板，使之贴壁生长或悬浮生长，称为细胞培养。,（八）组织和细胞的定量术,1.显微分光光度术 应用显微分光光度计，以各种物质分子对光的选择性吸收为基础，可以在显微镜
12、下对生物样本中的化学物质进行定量分析。 2.图像分析术 图像分析术（image analysis），即形态计量术（morphometry），是应用数学和统计学原理，对组织和细胞进行二维和三维的形态学测量方法，其中三维立体结构的研究又称体视学（stereology）。,3.流式细胞术,流式细胞术（flow cytometry）是一种细胞分类和定量技术，它可以对单个细胞进行生物化学和生物物理特性的快速定量测定，可进行不同细胞周期比例和细胞内DNA，RNA，蛋白质含量分析，淋巴细胞亚群的分离和定量，血细胞增殖状态分析，杂交细胞的分选等。,三、组织学与胚胎学学习方法,（一）加强结构与功能结合（二）强调理论与实践的结合（三）建立断面与立体的关系（图1-12） （四）注意勤奋与学习技巧,Thank you,
