1、目录摘要 .1Abstract.2第一章 绪论 .31.1 研究背景 .31.2 国内外研究现状及研究意义 .31.3 研究内容 .5第二章 Shewanella puterfaciens CN32 及测试指标标线 .52.1 CN32 菌准备 .52.1.1 收菌方法 .52.1.2 测收菌后 OD 值 .62.1.3 接菌 .62.2 铁标线 .62.3 菌体生长标准曲线 .72.4 SMP 蛋白标准曲线 .8第三章 不同铁源及电材料对 Fe(III)的还原效果的影响 .93.1 引言 .93.2 材料与方法 .103.2.1 培养基准备 .103.2.2 实验材料 .113.2.3 仪器
2、 .123.3 实验设计 .123.3.1 数据处理 .133.3.2 测定周期 .133.4 实验分析方法 .133.4.1 分析指标 .133.4.2 Fe(II)浓度 .133.4.3 黄素 .143.5 结果与讨论 .143.5.1 针铁矿及电材料对 Fe(III)的还原效果的影响 .143.5.1.1 溶解态 Fe(II) .143.5.2 NTA-Fe 及电材料对 Fe(III)的还原效果的影响 .193.5.2.1 溶解态 Fe(II) .193.6 本章小结 .24第四章 不同条件下细菌分泌蛋白的差异 .264.1 引言 .264.2 材料与方法 .264.2.1 培养基准备
3、.264.2.2 实验材料 .274.2.3 仪器 .274.3 实验设计 .284.3.1 数据处理 .294.3.2 测定周期 .294.4 实验分析 .294.4.1 分析指标 .294.4.2 菌体生长情况 .294.4.3 分泌蛋白浓度 .304.5 结果与讨论 .304.5.1 菌体生长 .304.5.2 细菌分泌蛋白 .32第五章结论与展望 .345.1 结论 .345.2 展望 .34第六章 致谢 .350不同铁源及导电材料的添加对 Shewanlla puterfaciens CN32 铁还原过程的影响摘 要：异化铁还原菌还原 Fe(III)是铁循环及能量流动的重要环节， 在
4、微生物的氧化还原反应中，铁氧化物充当电子载体，能够有效的加快微生物对有机物的降解。有研究表明通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活性，铁元素便是外来元素之一。在自然界中有很多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量，其中奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis 是研究最多的异化铁还原菌之一。所以本文以Shewanella puterfaciens CN32 为微生物 ， 研究的内容包括：1.考察了添加导电材料对 Fe(III)还原效果的影响，结果显示：以针铁矿为铁源时，添加石墨及 CNTs 对 Fe(III)还原有抑制作用。以 NTA-Fe 为铁源时，添加石墨及 CNT
5、s 能够刺激 Fe(III)还原。2.考察了不同铁源下对 Fe(III)还原效果的影响，实验结果表明游离态NTA-Fe 的 Fe(III)还原效果较固定态针铁矿的还原效果好。3.考察了不同的条件下细菌分泌蛋白的差异，结果表明添加石墨对分泌蛋白有促进作用，添加 CNTs 对分泌蛋白有抑制作用。关键词：Shewanella puterfaciens CN32；Fe(III) 还原；不同铁源；导电材料；分泌蛋白1The impact of adding different types of iron and conductive material on Shewanlla puterfaciens
6、CN32 iron reductionAbstract：Bacteria reduction of iron oxide Fe (III) is an important part of iron circulation and energy flow in the oxidation-reduction reaction of microorganisms, the iron oxide acts as an electron carrier, can effectively accelerate the microbial degradation of organic matter.it
7、is shown that by supplementing exogenous trace elements can effectively improve the anaerobic microbial activity, iron is one of foreign elements.There are many bacteria by reduction of ferric minerals for energy in nature, where the Oneida Lake Shewanella Shewanella oneidensis is one of the most st
8、udied alienation iron-reducing bacteria.So this paper use Shewanella putrefaciens CN32 as microorganisms, the study include:1.The effect of adding a conductive material to Fe (III) reduction effect, the results show: the goethite iron source, adding graphite and CNTs to Fe (III) reduction of inhibit
9、ion. In NTA-Fe is iron source, adding graphite and CNTs can stimulate the Fe (III) reduction.2.The effects of different iron sources under on Fe (III) reduction effect, the experimental results show that the free state NTA-Fe of Fe (III) reduction effect than the reduction effect of fixed goethite g
10、ood.3.The effects of differences in bacterial secreted proteins under different conditions, the results showed that addition of graphite can promote secretion of the protein, adding CNTs to inhibit the secretion of the protein.Keywords:Shewanella puterfaciens CN32;Fe (III) reduction;secreted protein
11、s; different iron source; a conductive material2第一章 绪论1.1 研究背景在土壤、沉积物及浅埋藏的环境中，存在着丰富的铁的氧化物（如水铁矿、赤铁矿及针铁矿等） 1,2，这些铁的氧化物是地球表层中最重要的铁资源。控制了地表系统中的 Fe(II)-Fe(III)的氧化还原就等于掌握了铁循环过程及能量流动的重要环节 3.4，其中含铁矿物的微生物氧化-还原作用越来越受到人们的关注 4，5 。部分异养厌氧型微生物在进行呼吸作用的同时还可以通过还原 Fe(III)来获得能量，这种铁的异化还原能力在许多生物、地球及化学循环中都起着举足轻重作用 6-10，也能
12、显著影响重金属污染的生物修复、金属腐蚀的控制及生物质能转化等 11-14 。所以，Fe(III)的还原是铁的生物、地球及化学循环过程的重要环节。目前已经发现了自然界中有许多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量 4 ，其中奥奈达湖希瓦氏菌 Shewanella oneidensis 是研究最多的异化铁还原菌之一 15-19 。Shewanella 属常见于土壤、沉积物、地表水和地下水，为革兰氏阴性异化金属还原菌，能利用氧气、高价金属以及变价无机盐类作为终端电子受体，获取生长所需能量 20-23。从细菌与针铁矿反应过程的研究中显示，在厌氧环境下 Shewanella puterfaciens
13、在针铁矿表面的吸附远强于有氧条件，并且由于细菌表面的还原酶多，可促进电子由细菌向矿物的表面有效转移 24,25。对比针铁矿与 +3 价游离铁离子的微生物还原作用，发现细菌易于直接还原游离态的 Fe 3+ 离子，而结晶态铁矿物的溶解还原则相对比较困难 26。有研究表明在蓝藻厌氧发酵产沼气是资源化的过程中,通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活性,铁元素便是外来元素之一 28。亚铁子能够有效的提高产甲烷菌酶的活性,而且铁氧化物是自然界中一种广泛存在且价廉易得的矿物,可以作为一种外源添加物在蓝藻的厌氧发酵中使用。Kato S 研究认为,在微生物的氧化还原反应中,铁氧化物充当电子载体,能够有效的
14、加快微生物对有机物的降解 29。1.2 国内外研究现状及研究意义在上世纪 70 年代国外就已经开始了有关异化 Fe(III)还原的研究，研究Fe(III)还原菌的分类、分离、分子机制及极端环境条件下异化 Fe(III)还原菌，在3研究生命起源及进化中起到重要的意义，异化 Fe(III)还原菌应用于放射性核素、石油等碳氢化合物和垃圾渗滤液污染的地下水的原位修复，异化 Fe(III)还原菌还在产生微生物燃料电池方面作了大量的原创性工作。虽然目前对 Fe(III)还原菌的研究已经做了大量的工作，但是国内在这方面的研究还比较少；国外大多数是关注于海洋、湖泊和沼泽等生态系统的研究，对蓝藻中的 Fe(II
15、I)还原菌研究却比较少。Fe(III) 还原菌的形态多异，营养类型多样。但是目前还没有获得能够为 Fe(III) 还原菌通用的功能性基因，这就极大的阻碍了 Fe(III) 还原菌在生态系统中的原位研究；如果能够借助于日益先进的生物分子学技术找到功能性基因，这将会大大促进 Fe(III)还原菌的研究和其在生物修复方面的应用。我国拥有大面积的湖泊资源，但很多湖泊及河流都受到了蓝藻的污染，所以十分有必要深入了解蓝藻中的 Fe(III)还原菌的多样性；且蓝藻是湖泊河流中的一种微生物，是由于大量氮、磷等营养元素的排入而产生的蓝藻爆发。Fe(III)还原菌既在生态系统中既是碳循环的驱动者，同时又是氮循环的
16、参与者。Fe(III) 还原菌如 Geobacter 除了参与还原铁氧化物外，还参与了 NO 3 、依赖型铁 Fe(III)还原和 Fe(III) - NH+4 很可能也具有与氧化还原耦合的关联。此外，Fe(III)还原菌 (Geobacter)还具有固氮酶，而固氮菌（ Clostridia）同时也是一种异化 Fe(III)还原菌。总之， Fe(III)还原菌与 C、 N 代谢有着密切的联系。深入的研究微生物介导的 C-Fe-N 耦合的机制，探究 Fe(III)还原菌在生态系统中 C、N 代谢的生态意义将会推动整个生态系统的生物地球的化学循环 30。Fe(III)还原菌在生物修复中有巨大的潜力
17、，研究 Fe(III)还原菌在生物修复中的应用,对开发出既经济又高效的修复途径在人类生态系统的健康发展方面具有重要时代意义。除了通过添加单一的电子供体来刺激 Fe(III)还原菌的生长来提高污染物的去除率之外，添加导电材料在 Fe(III)还原菌生物修复中的作用机制和应用同时也需要进一步研究。在自然界之中, Fe(III)能够被生物还原成 Fe2+。不管 Fe3+是以溶解态还是固态的形式存在。微生物细胞与固体矿物之间的电子传递是控制岩石圈能量交换的基本过程 27。Fe(III)不可能与外周胞质蛋白直接结合,因为它们是以难溶的固体形式存在于细胞表面之外,并且在大多数条件下不能通过细胞外膜。但是有
18、一些还原铁氧化物的细菌可以做到这一点,它们通过将相关细胞色素置于细胞外膜外表面使得其接触到氧化物表面从而实现传递电子 27。还有其他的机制包括生物合成具有电子受体和电子供体特性的水溶性有机化合物充当电子梭促进电子4传递 31。2008 年,Von Canstein 等 32，报道还原金属的希瓦氏菌属可以分泌核黄素(维生素 B2)和黄素单核甘酸(FMN)充当电子梭促进结晶度低的 Fe3+氧化物的还原。1.3 研究内容本文采用希瓦氏奥奈达菌（Shewanella puterfaciens CN32，简称 CN-32）CN-32 为研究菌株和人工合成的针铁矿、人工配置的 Fe-NTA 为两种不同的电
19、子受体，并在不同电子受体的培养基中加入导电材料 CNTs 或石墨。构建营养充足的、pH 为中性的厌氧环境体系，研究了 不同铁源及导电材料的添加对Shewanella puterfaciens CN32 铁还原过程的影响研究，讨论了不同铁源及导电材料的添加对 Fe(III)的还原效果的影响及不同条件下细菌分泌蛋白的差异。第二章 Shewanella puterfaciens CN32 及测试指标标线2.1 CN32 菌准备所用菌种为奥奈达湖希瓦氏菌 Shewanella puterfaciens CN32 由中国海洋微生物菌种保藏管理中心提供(MCCC ，编号 1A01706)。培养基：好氧培养
20、基为 LB 培养基参考分子克隆实验指南 33，pH 7.2。CN-32 菌株的活化、传代和培养均在好养培养基中进行，使用 LB 培养基（10 g/L 蛋白胨， 5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl）于室温下活化三代。然后进行洗菌和收菌。2.1.1 收菌方法燃烧的酒精灯边，12000 rpm,5 min,洗涤 3 次。需要的仪器：预先灭菌:50mL 压盖式离心管（保鲜袋装），1mL 移液枪，200mL 无机培养基；需提前准备但无需灭菌：冰盒（取冰用），废液缸，酒精灯，打火机。收菌及洗菌时重悬洗菌的操作方法：（操作必须在酒精灯边，并且每次使用都要用火焰轻燎，保证无菌）离心后弃去上清夜，燃烧的
21、酒精灯边，菌体沉淀中用灭菌过的 1mL 抢打入 5mL 无机培养基，反复抽吸直至分散完全，将离心管盖及管口在火焰边轻晃后盖紧离心管进行离心，第 3 次洗菌可以将菌液用枪5合并在一起后进行。2.1.2 测收菌后 OD 值取 0.1mL 浓缩菌，稀释至 10mL 后用紫外分光光度计测定，波长为 600nm.2.1.3 接菌将所需浓缩菌液按照收菌后的 OD 值算好，在无氧条件下，用 1mL 一次性针管取菌也注入灭好菌的厌氧瓶中。2.2 铁标线试剂：（1）铁标准储备液：精确称量 0.7020g 硫酸亚铁铵(（NH 4)2Fe(SO4).6H2O ),溶于 50mL 的（1+1）硫酸中，转移至 1000
22、mL 的容量瓶中，加水至标线，然后摇匀。此时溶液中每升 100g 铁。（2）铁标准使用液：精确移取 25mL 铁标准储备液于 100mL 的容量瓶中，加水至标线，摇匀，此时溶液中每升 25g 铁。（3）（1+3）盐酸。（4）10%盐酸羟胺溶液。（5）缓冲溶液：40g 乙酸铵加入 50mL 冰乙酸最后用水稀释到 100mL。（6）0.5%邻菲啰啉（1,10-phenanthroline）水溶液，加入浓盐酸帮助于溶解。步骤：依次移取铁标准使用液 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0 置于 150 锥形瓶中，加入蒸馏水至 50mL，再加入 1mL 的（1+3 ）盐酸，1mL10%盐酸
23、羟胺溶液，之后加入 1-2 粒玻璃珠。加热煮沸至溶液剩 15mL 左右，冷却至室温，定量转移至 50mL 具塞比色管中。加入一小片刚果红试纸，滴加饱和乙酸钠溶液至试纸刚变红，加入 5mL 缓冲溶液，2mL0.5%邻菲啰啉，加水指标线，摇匀。显色15min 后，用 10mm 比色皿，以水为对照，在 510nm 处测吸光度。测得的标线为：表 2.1 铁标线6浓度(mg/L) 吸光度0 0.0831 0.2942 0.5043 0.6794 0.8695 1.068图 2.1 铁标线2.3 菌体生长标准曲线Bradford 蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质，设置 10、
24、20、40、80、100 及 200mg/L 等不同浓度。移取 0.1mL 0.5mol/L NaOH 溶液加入 0.9 mL 蛋白质标准物质， 121 下加热 20 min 裂解细胞。待充分冷却后，离心悬液（12000rpm,5min ），去 0.2 mL 上清夜与 1 mL Bradfor 试剂（生工）混合 (1.5 mL 离心管内)，利用分光光度计于 595 nm 波段读取光度值。表 2.2 菌体生长标线7浓度(mg/L) 吸光度0 010 0.0820 0.14240 0.25080 0.432100 0.524图 2.2 菌体生长标线2.4 SMP 蛋白标准曲线Bradford 蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质，设置 10、20、40、80、100 及 200mg/L 等不同浓度。移去 0.2 mL 上清夜与 1 mL Bradfor 试剂（生工）混合(1.5 mL 离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。 表 2.3 菌体分泌蛋白标线
