1、乳酸发酵酸菜的应用研究专 业：食品科学与工程专业摘 要本论文以实验室提供的短乳杆菌 S1-3 和植物乳杆菌 Sc6-3、Sc9-6 三株乳杆菌为供试菌株，经测定其生长特性的基础上尝试发酵酸菜试验。结果显示，三株乳酸菌的最适生长温度均为 30-35，能够耐受的最大盐浓度为 7%。用不同菌种组合的发酵剂发酵白菜，筛选出的最佳菌种组合为：D1 （S1-3:Sc9-6=1:1 ） ；产品最佳发酵工艺参数为：接种量 3%、盐浓度 5%、发酵温度 20、发酵时间3 天。D1 组混合菌种的生产酸菜过程中，在发酵的初期 (ld-3d)产酸速率远远大于对照组，其产酸量比对照组高 8.0 倍，亚硝酸盐含量明显降低
2、。关键词：酸菜；乳酸菌；筛选.AbstractThis paper provides a short laboratory S1-3 and Lactobacillus plantarum Sc6-3, Sc9-6 for the three strains of Lactobacillus strains tested, the growth characteristics were determined based on the attempt to fermented vegetable trials. The results showed that three strains of l
3、actic acid bacteria are the optimal growth temperature 30-35 , can withstand the maximum concentration of 7%. With different combinations of starter strains fermented cabbage, the best strains selected combination of: D1 (S1-3: Sc9-6 = 1:1); product optimal fermentation parameters were: 3% inoculum,
4、 salt Concentration of 5%, fermentation temperature 20 , the fermentation time of 3 days. D1 group of mixed bacteria during the production of sauerkraut, in the early stages of fermentation (ld-3d) acid production rate far greater than the control group, the acid production 8.0 times higher than the
5、 control group, significantly increase nitrite content decreased.Key words : Fermented vegetable ; Lactic acid bacteria (LAB) ; Filter目 录1 前言 .11.1 概述 .11.2 酸菜的发酵机理 .11.3 乳酸发酵对蔬菜的意义 .31.3.1 提高蔬菜制品的营养价值 .31.3.2 改善蔬菜制品的风味 .31.3.3 延长蔬菜制品保质期 .31.3.4 增加蔬菜制品的保健作用 .31.3.5 丰富蔬菜制品的花色品种 .41.4 本研究的目的和意义 .42 材料
6、与方法 .52.1 试验材料 .52.2 仪器设备 .52.3 试验方法 .52.3.1 供试菌液的制备 .52.3.2 供试乳酸菌的温度生长特性 .52.3.3 供试乳酸菌的耐盐试验 .52.3.4 最佳发酵组合的筛选试验 .62.3.5 发酵试验 .62.3.6 感官品质评价: .72.3.7 纯菌发酵对酸菜产品质量的影响 .73 结果与分析 .83.1 最适生长温度试验结果 .83.2 耐盐试验的结果 .103.3 最佳发酵菌种组合的筛选及发酵试验结果 .113.3.1 发酵菌株组合的筛选 .113.3.2 发酵试验结果 .133.3.3 纯菌发酵对酸菜产品质量的影响 .154 结论 .
7、17致谢 .18参考文献 .19作者简介 .20农业大学学士学位论文1 前言1.1 概述酸菜是一种独特且具有悠久历史的大众的乳酸发酵蔬菜制品。酸菜的起源最早可追溯到距今 3100 多年前的商朝， 商书.说明记载有“欲作和羹，尔惟盐梅”，说明在商代，我国劳动人民就能用盐来演梅供烹饪用；周礼.天官记载：“下羹不致五味，铡羹加盐菜” ，所谓羹是用肉或咸菜做成的汤。中国最早的诗集诗经记载：“中田有庐，疆场有瓜，是剥是菹，献之皇祖” ， “庐”和“瓜”是蔬菜， “剥” 和“ 菹” 是腌渍加工的意思，据汉许慎说文解字解释“ 菹菜者，酸菜也” 1。北魏著名的农学家贾思勰在齐民要术 中较为系统和全面地介绍了酸
8、菜的种类和制作方法。酸菜的制作过程是以乳酸发酵为主、兼有醋酸发酵、酒精发酵等的微生物发酵过程，它是一种冷加工方法，这对蔬菜的营养成分、色香味体的保持都极为有利。到二十世纪初，酸菜制作一直沿袭传统的自然发酵工艺，而且几乎全是家庭作坊式生产，规模小，产量低，甚有相当一部分制作是采用非发酵型浸制工艺。后来人们逐渐将酸菜生产产业化，但都是小规模生产，在制作工艺方面，粗加工多，深加工、精加工少，产品质量不稳定。随着微生物学的发展，人们开始将人工接种发酵用于酸菜的生产。近年来，国内外许多研究者致力于酸菜中微生物及酸菜发醉种子和工艺的研究，并将其应用到生产中，使酸菜产业有了进一步的发展。1.2 酸菜的发酵机
9、理二十世纪初，随着微生物的发展，人们才将酸菜的腌制与微生物的活动联系起来。近代研究发现，当乳酸浓度为 1.5%2.5%、pH 值为 3.63.8 时，蔬菜即可长期保存。新鲜蔬菜在发酵过程中碳水化合物只有轻度分解，乳酸菌几乎不能分解纤维素和蛋白质，而且酸菜中的纤维素不会减少，维生素 C 则稍有减少。但乳酸发酵使产品的酸度增加，其它细菌，特别是一些起腐败作用的细菌不容易繁殖，所以能长期保存。由于酸的作用，改变了原有蔬菜的感观特性，组织结构变得更益于消化吸收。我国蔬菜资源丰富，酸菜作为一种传统的乳酸发酵蔬菜制品，其汁中富含乳酸菌活菌，对其深入研究且开发利用，对提高人民健康水平、开发蔬菜加工品种、蔬菜
10、原料的综合利用有着积极意义 2，3 。但乳酸菌的生长对营养的要求与其他细菌相比严格且复杂。所以乳酸菌制品工业化生产带来不便。酸菜中微生物方面的研究 Hennbeery 首先在细菌发酵手册中提到了乳酸杆菌属和片球菌属的某些种类 4。二十世纪六十年代，Pederson 和 Albuyr 等乳酸发酵酸菜的应用研究5研究了酸白菜、酸黄瓜等发酵过程中的菌系消长规律，发现在发酵早期明串珠菌很活跃，随后是啤酒片球菌、短乳杆菌和植物乳杆菌大量产酸，最后是植物乳杆菌完成发酵过程。新鲜蔬菜上占优势的微生物是革兰氏阴性好氧菌和酵母，而生产的初期，乳酸菌的数量较少 6，7 。但是，在缺氧、湿润的条件下，当盐浓度和温度
11、适当时，乳酸菌的生长则处于优势，大多数蔬菜或蔬菜汁都要经历乳酸发酵阶段。在自然发酵时，最初为异型发酵或产气阶段，然后是同型发酵或不产气阶段 8。发酵初期是肠膜明串珠菌的异型发酵阶段，此时它的数量最多，且生长繁殖速度快，这是因为肠膜明串珠菌比发酵液中的其他乳酸菌的世代周期要短 9。但是，它对酸的敏感性较强，随着发醉的进一步进行就会很快死去。在我国，蔬菜发酵微生物学开始于二十世纪四十年代，方心芳指出在泡菜的发酵过程中有多种酵母、细菌参与，其中主要的产酸菌是乳酸菌。赵学慧对泡菜发酵过程中的化学变化和微生物性状进行了较为深入的研究，认为在泡菜发醉中以正型乳酸发酵为好，可使发醉液中糖分转化为尽可能多的乳
12、酸 10。杨瑞鹏对几种蔬菜发酵过程中的主要乳酸菌进行了分离鉴定，并对其菌系变化进行了初步分析，并研究了典型菌株的发酵生理特性及其混合培养中环境因素的影响 11，对自然发酵过程中乳酸菌系变化进行了验证。乳酸发酵是发醉蔬菜生产过程中最主要的发酵作用，参与发酵的乳酸菌种类及其作用范围必然对产品品质产生重要影响。食盐浓度与发醉温度是影响蔬菜发酵过程中乳酸菌区系的两个重要因素。食盐对在一定浓度下，对乳酸菌区系中菌种构成、乳酸菌菌数与活动范围，以及发酵产酸量都能产生影响。有研究表明，随着食盐浓度上升，肠膜明串珠菌与小片球菌菌数显著下降 12。同时，由于食盐的存在，小片球菌从区系中消失的时间明显提前。食盐对
13、植物乳杆菌的最大菌量无显著影响，但它使植物乳杆菌大量繁殖的时间推迟，并很快进入衰降。在较低的发酵温度下，发酵前期，肠膜明串珠菌和小片球菌在乳酸菌区系中占有优势。随着温度升高，这种优势减弱直至消失。要获得高质量的发酵蔬菜产品，必须迅速控制植物组织内酶和有害微生物的活动，在发酵初期迅速降低 pH 值是必要的。然而食盐对乳酸菌发酸产酸有明显的抑制作用。因此，在蔬菜发酵初期，为了有利于肠膜明串珠菌等的大量生长和繁殖，适当降低盐浓度和发酵温度是非常必要的。肠膜明串珠菌、小片球菌和植物乳杆菌的生长温度范围分别为 8-32、 15-37,15-4013。农业大学学士学位论文1.3 乳酸发酵对蔬菜的意义1.3
14、.1 提高蔬菜制品的营养价值因为乳酸菌不具备分解纤维素和水解蛋白质的酸系统，所以它们在发酶蔬菜的过程中既不会破坏植物细胞的组织，也不会降低蔬菜原料的营养价值；相反，乳酸菌利用原料的可溶性物质代谢产生的多种氨基酸、维生素和酶，还提高了发酵制品的营养价值。研究结果表明，乳酸菌每升培养基胞外维生素的产量可高达 VB1 25g250g、V B2 10g、V B6 100g、V B12 0.6g、烟酸 400g、叶酸 25g18。1.3.2 改善蔬菜制品的风味乳酸菌通过同型或异型发酵，产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，它们赋予发酵蔬菜制品柔和的酸味;同时乳酸菌发酵蔬菜过程中产生的 2庚酮、2壬酮可赋予产品爽
15、口、清香的口感。乳酸发酵蔬菜制品既有乳酸发酵的怡人香味，又不失蔬菜的原料鲜香脆嫩的自然风味，这两种风味浑然一体，赋予了蔬菜乳酸制品的独特风味 19，20。1.3.3 延长蔬菜制品保质期乳酸菌在厌氧发酵和发酵过程中产酸造成的酸性环境可抑制一些腐败菌与病原菌的生长。乳酸菌细胞还能产生许多具有抗菌活性的物质，如：有机酸(乳酸、乙酸和丙酸) 、乙醇、双乙酞、过氧化氢和细菌素等。近年来，国外食品行业热衷于把细菌素作为天然微生物防腐剂添加到食品中去，替代一些人工合成的食品防腐剂。有关实验表明，由甘蓝上分离得到的乳酸菌可产生抑制金黄色葡萄球菌的细菌素 21。目前，乳酸链球菌素(Nisin)作为天然防腐剂己获
16、得许多国家和地区允许 22，23 。它对革兰氏阳性菌具有广谱的抑制作用；可见无论乳酸菌菌体，还是其代谢产物，都可有效防止食品败坏。1.3.4 增加蔬菜制品的保健作用乳酸菌是参与调节人体肠道微生态平衡的主要菌系。食用乳酸菌发酵蔬菜制品，人体除吸收蔬菜营养的成分外，摄入的乳酸菌菌体及其代谢产生的有机酸，可促进胃肠道蠕动，帮助消化，防止便秘，同时刺激肠道免疫细胞产生抗体，防治疾病。此外还具有抑制肠道中腐败细菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒，防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用。乳酸发酵酸菜的应用研究1.3.5 丰富蔬菜制品的花色品种由于蔬菜乳酸发酵制品兼具乳酸发酵风味
17、和蔬菜原料风味的特点，是一种食品再生产过程，其制品品种会大大增长。例如以黄瓜乳酸发酵盐坯为主所生产的酸黄瓜制品有十余种。可用于乳酸发酵的蔬菜种类很多，在欧共体食品生物技术研究的报告中，列举出了 21 种欧洲用作乳酸发酵的种类。当前，茄子、蕃茄、白菜、萝卜、卷心菜、胡萝卜、黄瓜、苏叶等许多蔬菜的乳酸发酵制品的开发国内外都有报道。1.4 本研究的目的和意义发酵蔬菜历史悠久，发展前景广阔。作为我国北方传统发酵食品的酸菜，因其风味独特、营养易于吸收、口感清爽、酸味浓郁醇厚而广泛受到人们的欢迎。以酸菜为主料烹制的许多菜肴，已构成我国北方地区饮食文化的一大特色。酸菜的生产目前以两种方式进行：一是家庭式的传
18、统生产，二是工业化规模生产。家庭式酸菜传统生产采用自然发酵法;而工业化规模生产采用自然发酵和乳酸菌发酵两种方式。自然发酵周期长(一个月左右)、杂菌及其他有害物质污染无法控制、卫生质量难以保证。近年来，随着现代食品加工技术和食品生物技术研究和应用的不断发展，特别是喜爱酸菜的消费人群在国内外的迅速增加和消费范围的迅速扩大，酸菜由家庭的传统生产向现代化、规模化、工厂化生产转化;由自然发酵向纯菌种发酵转化。目前国内酸菜企业多采用自然发酵工艺，该工艺的弊端主要有:(1)发酵周期相对较长，生产力低下;(2)受卫生条件、生产季节和用盐量影响，发酵易失败;(3)发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准化生产
19、:(4)亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差。本研究旨在筛选出用于酸菜发酵的优良菌种，并对其生长特性进行研究。研究成果对促进和加快酸菜这一传统食品的现代化生产，缩短酸菜生产周期，降低生产成本，提高酸菜的产品质量，提高产品生产的技术含量和经济效益等均具有重要意义。2 材料与方法2.1 试验材料菌种：实验室提供农业大学学士学位论文培养基：液体 MRS(Man Rogosa Sharpe broth)培养基：准确称取蛋白胨 1g、牛肉膏 1g、酵母粉 0.5g、D-葡萄糖 2g、吐温-80 0.1g、磷酸氢二钾 0.2g、醋酸钠 0.05g、柠檬酸钠 0.05g、无水硫酸镁 2mg、无水硫酸锰 5.4
20、mg,将其溶在 100ml 蒸馏水中，过滤，在 121，15min 灭菌备用；发酵材料：大白菜（购于东瓦窑菜市场） ，食用盐（购于超市）2.2 仪器设备AIRTECH 超净工作台、YM50 全自动立式高压灭菌器 、LRH-250 生化培养箱 、PB-10 pH 计、分光光度计、干燥箱、电子天平、玻璃仪器等2.3 试验方法2.3.1 供试菌液的制备取冷冻干燥保存的乳酸菌菌株，在 MRS 培养基中活化三代 (取 100L 菌液接种到 5mlMRS 培养基中，培养 24h 后的培养液经离心（3000r/min ，10min）收集菌体，用等体积灭菌生理盐水离心洗涤 3 次，将菌体悬浮于 5ml 灭菌生
21、理盐水中制成供试菌液。2.3.2 供试乳酸菌的温度生长特性将供试乳酸菌菌株按 1%接种到 MRS 培养基中，分别在 15、20、25、30、 35、 40下培养。OD 值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在凯锐-6 分光光度计上，用最大吸收光波长入=600nm 测定其吸光值，以确定其最适生长温度。2.3.3 供试乳酸菌的耐盐试验以 1%接种量将活化的供试乳酸菌菌株接种于0%、1%、2%、3%、4%、 5%、6%、7%、8%、9% 、10%NaCI 的 MRS 培养基中，30培养，培养 24h、 48h 取样，测定 OD600 值，确定菌株生长与盐浓度的关系。2.3.4 最佳发酵组合
22、的筛选试验将供试乳酸菌在培养基中活化三代后，进行菌落计数，确定接种量。因 3种菌计数在同一数量级，且相差不大，约为 l108 个/mL 。确定接种量为 3%(占盐水总量)，发酵液中含菌量约为 1l06 个/mL 。菌种数量比近似于相应菌种培养乳酸发酵酸菜的应用研究基体积比。发酵菌种按表分组，同时设不接种作对照。用 500mL 棕色瓶混菌发酵酸菜试验，温度 30，食盐 5%。以 pH 值和产酸量为综合指标，确定最佳发酵菌种组合。发酵菌种组合见表 1。表 1 发酵菌种组合的筛选试验方法混合菌种发酵单菌发酵S1-3:Sc6-3 Sc6-3:Sc9-6 S1-3:Sc9-6 S1-3:Sc6-3:Sc
23、9-6A1(S1-3) B1(1:1) C1(1:1) D1(1:1) E1(1:1:1)A2(Sc6-3) B2(1:2) C2(1:2) D2(1:2) E2(1:2:1)A3(Sc9-6) B3(2:1) C3(2:1) D3(2:1) E3(2:1:1)E4(1:1:2)2.3.5 发酵试验工艺流程工艺流程： 供试乳酸菌活化（三代） 供试菌液接种或不接种 白菜晾晒清洗切分烫漂称量装罐用盐水浸泡培养成品最佳发酵条件的筛选采用 L9(3)4 正交试验，利用筛选出的发酵剂进行发酵试验。以产酸量和感官性状为综合指标，确定最佳发酵条件。最佳发酵条件因素和正交试验表见下表。表 2 最佳发酵条件因素水平表因素 A 因素 B 因素 C 因素 D水平接种量（% ） 发酵时间（d） 盐水浓度(%) 温度（）1 1 3 3 202 3 6 5 253 5 9 7 30表 3 最佳发酵条件正交试验表因素试验号A B C D1 1 1 1 1
