1、1植物染色体组型分析一、实验目的1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。3.观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征；学习染色体组型分析的方法。二、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。每一细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析就是研究一个物种细胞核内染色体的数目及各种染色体的形态特征，如对染色体的长度、着丝点位置、臂
2、比、随体有无等观测，从而描述和阐明该生物的染色体组成，为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供实验依据。染色体组型分析大都采用植物根尖等分生组织的有丝分裂中期细胞，染色体制片要求分裂相为染色体分散，互不重叠，能清楚显示着丝点位置。然后通过显微摄影，测量放大照片上的每个染色体的长度和其它形态特征，依次配对排列，编号，并对各对染色体的形态特征作出描述。三、实验材料1.材料：洋葱（Aillumcepa）的鳞茎，黑麦，蚕豆（Viciafaba）的种子， 2.用具：载玻片，盖玻片，50ml 烧杯，温度计，恒温水浴锅，试剂瓶，镊子，解剖针，吸水纸，剪刀，绘图，纸胶水等。3.药品：Carnoy 固定液，7
3、0酒精，酸酒精，0.002M8- 羟基喹啉，饱和对二氯苯水溶液，秋水仙素，1mol/HCl，石碳酸品红染色液。四、方法与步骤（一）植物有丝分裂1、材料处理先将种子用 0.10.2%升汞（ HgCl2）消毒 10 分钟，清水洗净后，置于 23-25下发根至 0.5cm，再移入 0.05-0.1%秋水仙素溶液，根尖朝下且浸在药液中，25下培养直至根尖膨大。将洋葱，或黑麦，或蚕豆发根，待根长到 1.5-2.0cm 左右时备用；在分裂高峰期前 3h，用 0.002M8-羟基喹啉，或对二氯苯饱和水溶液，或 0.02秋水仙素溶液中，预处理 34h；或放入冰箱(04 )中预处理 24h。前处理的作用，主要是
4、阻碍纺锤丝的形成，使染色体缩短，改变细胞质的粘度，在压片时，有利于染色体的分散。2、材料固定经过前处理的根尖，再放到 Carnoy 液中固定 24h 以内。固定材料可以转入 70酒精中，在 4冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。固定的目的在于将细胞迅速杀死，使细胞结构尽可能保持原来的状态。3、材料解离方法：从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，再放到：1mol/LHCl 中，在 60水浴中恒温解离 810min；用 95的酒精 浓盐酸11 的溶液处理 810min；倒去解离液，再加入固定液 5ml，软化 5min，然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使2材料呈白色微透明。4、制压、镜检切取根尖分生组
5、织放在清洁的载玻片，剥取分生组织，滴加 1-2 滴苯酚品红染液，染色 812 min 后加上盖玻片，覆以吸水纸压片， 45%醋酸粉色、镜检。（二）核型分析1、测量：依次测量放大照片各染色体长臂和短臂的长度（随体是否计入臂长须注明） 。根据测量、记录染色体形态测量数据计算：绝对长度（m）=放大的染色体长度 放大倍数染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和相对长度（%）=每个染色体长度染色体组总长度100臂比=长臂长度短臂长度着丝粒指数=短臂该染色体长度1002、配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴
6、配对。3、排列：染色体对从大到小依次排列；等长染色体对，短臂长的在前；具随体染色体、性染色体可单独排在最后。异源的染色体要分别排列（如小麦的 A、B、D 染色体组）4、剪贴：把上述已经排列的同源染色体按先后顺序粘贴在绘图纸上。粘贴时，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在一条直线上。所得组型图。5、分类： 臂比是反应着丝点在染色体上的位置。根据此可确定染色体所属的形态类型。染色体形态类型：臂比（长臂/短臂） 形态类型。11.7M 中着丝粒染色体；1.713.0SM 近中着丝粒染色体；3.017.0 ST 近端着丝粒染色体；7.01T 端着丝粒染色体；SAT 随体染色体。6、填表：将上述结果整
7、理成“染色体形态测量数据表”染色体序号绝对长度（um）相对长度%臂比（长/短）染色体类型1 17.5 23.9 1.26 M2 15.5 21.1 1.21 M3 14.24 18.9 1.59 M(SAT)4 13.5 18.4 2.375 SM5 13 17 7 7 0 M总长度：73.75 um(单倍的染色体实际总长) 平均相对长度：207、综合描述计数体细胞染色体数目：统计细胞数30，85%具有恒定一致的数目；以分裂中期、高质量的体细胞染色体图像作为形态描述，以 5 个以上的细胞染色体，测其平均值。核不对称系数（Ask）长臂总长全组染色体总长100%染色体的长短：按 Kuo 等的方法，
8、以染色体相对长度系数（I.R.L）组成划分染色体的长短，即 I.R.L1.26 为长染色体（L） ；1.01I.R.L1.25 为中长染色体（M 2） ；0.76I.R.L 1.00 为中短染色体（M 1） ；I.R.L0.76 为短染色体（S） 。2n=24=8L+2M2+10M1+4S。3相对长度系数（I.R.L）= 每条染色体的相对长度染色体的平均相对长度染色体组型分类：Stebbins(1971)核型分类表。臂比值2 的染色体的百分比染色体长度比 0.00 0.01-0.50 0.51-0.99 1.002 ：1 1A 2 A 3 A 4 A2：1-4：1 1B 2 B 3 B 4 B
9、4：1 1C 2C 3C 4C染色体长度比最长染色体长度最短染色体长度染色体组型类型 1A 为最对称型， 4C 为最不对称型。染色体组型的公式：芍药 2n=2x=10=8M(2Sat)+2SM=6M+2SAT+2SM染色体组型模式图：根据各染色体的相对长度平均值绘制一坐标图。横轴上标明各染色体序号，每一染色体与其序号相对应，纵轴表示相对长度值() ，零点绘在纵轴的中部，并与各染色体的着丝点相对应。此即为该细胞的染色体组型模式图。六、实验报告做出蚕豆的染色体组组图、染色体组型分析表、染色体组型模式图。染色体形态测量数据表染色体序号 项目长臂长度q短臂长度p染色体全长q+p臂比q/p染色体类型实测
10、值（mm） 绝对长度（um） 1相对长度（%） M(SAT)实测值（mm） 绝对长度（um） 2相对长度（%） 实测值（mm） 绝对长度（um） 3相对长度（%） n4总长度：73.75 um(单倍的染色体实际总长) 平均相对长度：20；测微尺：x mm10um5姐妹染色单体色差方法一、实验原理在 DNA 复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine简称 BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2-deoxyuridine 简称 IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的 DNA 链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。哺乳类细胞在含有适
11、当浓度的 BrdUrd 的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的 DNA 双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股 DNA 的 T 位完全由 BrdUrd 代替，而另一条染色单体的两股 DNA 中的一股含BrdUrd，另一股则不含 BrdUrd。这样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股 DNA 链都含有 BrdUrd 的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd 的单体荧光较弱。但由于荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保存。1974年 Korenb
12、erg 和 Freedlender 改进了这一技术，单独用 Giemsa 染色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatiddifferentialstaining 简称 SCD） 。来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换（sister-chromalidexchange，简称 SCE） 。这种互换是完全的，对称的。由于姐妹染色单体染色上的明显差异，如果姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段，故 SCE 易于计数，即使在一定距离内发生多次互换，也可被检测出来。目前认为 SCE 反映了 DNA 的损伤，可以使用
13、SCE 作为哺乳类动物突变形成的指标。由于 SCE 分析方法比观察染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现出很好的剂量效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常规指标之一。二、实验试剂1. RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA） ，秋水仙素，青、链霉素，姬姆萨染液等。2. 小牛血清：最好经过透析处理。将小牛血清装入透析袋中，用线扎紧封口，小心检查，切勿有漏孔。然后将透析袋放在盛有双重蒸馏水的玻璃器皿中，每隔12小时换一次水，搁置在4冰箱中，24小时后赛氏滤器灭菌过滤。3. 3.5% NaHCO3溶液：称3.5克 NaHCO3，用100毫升双蒸水溶解，10磅15分钟高压灭菌，调节
14、pH 用。4. BrdUrd 溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下用分析天平称取 BrdUrd2毫克，然后在无菌室内加入灭菌生理盐水4毫升，母液的浓度为0.5毫克/毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最好现配现用。65. 1 mol/LNaH2PO4，pH8.0的溶液；称取120克 NaH2PO4，加入1 000毫升双蒸水，用 NaOH 粉末调 pH 至8.0即可。6. 2SSC 溶液（0.3 mol/L 氯化钠，0.03 mol/L 枸橼酸钠，称取 NaCl 17.54克，枸橼酸钠8.82克，各用蒸馏水1 000毫升溶解，使用时两溶液等量混合。7. pH 为6.8 的 mol/L/15磷酸缓冲液：
15、甲液：取 KH2PO49.08克，溶于1000毫升蒸馏水中。乙液：取 Na2HPO22H2O11.88克或 Na2HPO412H2O23.87克，溶于1 000毫升蒸馏水中，将50.8毫升的甲液与49.2毫升乙液混合，即得 pH 为6.8的 mol/L/15磷酸缓冲液。三、实验设备1. 2毫升和1毫升灭菌注射器2. 吸管，移液管，离心管3. 量筒，烧杯4. 无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶5. 酒精灯6. 载玻片7. 天平8. 紫外灯（15 W）9. 离心机10. 恒温培养箱11. 显微镜四、实验材料人的外周血。五、实验步骤1. 在无菌条件下，用20毫升的青霉素瓶分装5毫升培养液，其中 RPMI1
16、640占80%；7小牛血清占15-20%；PHA 0.2毫升；青霉素 100单位/毫升；链霉素100微克/毫升。最后用3.5% NaHCO 3调节 pH 至7.2-7.4。2. 每5毫升的培养液中加入 BrdUrd0.1毫升，最终浓度为10微克/毫升。3. 每瓶培养液中加入0.3毫升静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37温箱中培养。4. 培养72小时左右，加入秋水仙素0.4-0.8微克/毫升，继续培养4小时。5. 按常规收集细胞，用0.075 mol/LKCl 或蒸馏水低渗20分钟，用甲醇：冰醋酸3：1配制的固定液固定两次，每次15分钟，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入70-80烤箱中
17、烘烤1-2小时，或放在37温箱中存放备用。6. 染色体标本的差别染色方法有两种：（1） 碱的热溶液处理：将染色体标本浸在 88的 1 mol/LNaH2PO4（pH 为8.0）的溶液中，处理20分钟，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规 Giemsa 染色5分钟，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。（2） 紫外灯照射诱发：染色体标本在37条件下搁置24小时后取出，放在4548的水浴锅上，覆盖一层2SSC 溶液（0.3 mol/LNaCl，0.03 mol/L 枸橼酸钠） ，15 W 紫外灯照射20-30分钟，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2SSC 溶液干涸） 。照射完毕，用蒸馏水冲去2SSC，用
18、3%Giemsa（pH6.8磷酸缓冲液稀释）染色510分钟，水洗，气干后镜检。7. 在普通光学显微镜下观察，可见姊妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。六、注意事项1. 在本方法的基础上，如将培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培养时间等因素略加变动，可适用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋巴细胞的培养，用以观察它们的姊妹染色单体色差。例如中华大蟾蜍淋巴细胞培养时，所用的培养基组成除 RPMI1640外，还补充一定量的水解乳蛋白，培养基的 pH为7.0-7.2，培养温度为26。2. BrdUrd 溶液最好现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4冰箱保存。3. BrdUrd 在培养开始时加
19、入，或在培养后的24小时加入均可。4. 用紫外灯照射诱发姊妹染色单体互换时，如紫外灯功率大，W 数高，照射的时间就相应地减少。8遗传多样性的分子检测 (DNA 指纹技术)【实验原理】 “DNA 指纹”是指利用 DNA 差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以 DNA 的多态性为基础，而卫星 DNA 的发现则是其最重要的奠基石。 卫星 DNA 是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星 DNA，重复单位的碱基序列
20、在不同个体中具有高度的保守性，而卫星 DNA 的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类 1 号染色体上的 VNTR D1S80，核心序列由16 个核苷酸组成，拷贝数在 1441 个之间，已知有 29 种不同的等位基因。DNA 指纹图谱的基本特点： 多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。 高变异性：DNA 指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同 DNA 指纹图谱的概率仅为 510-19，因此，
21、除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的 DNA 指纹图谱完全相同。 稳定的遗传性：DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代 DNA 指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.0010.004 之间。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的 DNA 作出的 DNA 指纹图谱是一致的。【材料】人类口腔细胞。【仪器与试剂】1 仪器微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR 仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪） 。枪头，1.5mL，0.2 mL 离心管，棉签，使用前均需 121高温灭菌2
22、试剂NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA 相对分子质量标记，Chelex 100 树脂（Bio-Rad ） ，PCR pre-mix。3溶液配制（1）5% Chelex 树脂Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g50mmol/L Tris-HCl 10mL用 4mol/L NaOH 调 pH 至 11，室温可保存 3 个月，使用前充分混匀。（2）2.0琼脂糖凝胶称 2.0g 琼脂糖放入 250ml 三角烧瓶，加 入 1TAE 溶液 100mL 微波炉加热溶解，冷却至 60左右加入 1g
23、/mL 溴化乙锭（EB ） ，缓慢混匀后倒胶板。（3）溴化乙锭（EB）用无菌水配制 5mg/mL 储藏液，工作浓度 1g/mL。注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。9（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0)Na2-EDTA 18.61gNaOH 2g蒸馏水定容至 100mL，室温保存。（5）10TAE 电泳缓冲液Tris 48.4g冰醋酸 11.42mL0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL蒸馏水定容至 1000mL，室温保存。（6）10%SDSSDS 10g 用无菌水溶解后（可加热） ，定容至 100mL，室温保存。（7）蛋白酶 K 溶液20m
24、g/mL 蛋白酶 K 水溶液 5mL10%SDS 1mL无菌水 94mL冰箱冷藏。（8）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。（9）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)将 12.1g Tris 溶解在 80mL 蒸馏水中，加盐酸调节 pH 至 8.0，加蒸馏水定容至100mL。4引物Primer1：5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3Primer2：5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3【实验步骤】1收集 DNA 样本（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入 1.5mL 装有 1mL 无菌水的小离心管中，使粘附在
25、牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好） 。震荡10s，10000 r/min 离心 1min。（2）从离心管中吸出 970L 无菌水，注意不要吸到沉淀。（3）向离心管中加入 200L 5% Chelex 100，震荡 10s 混匀。（4）加入 2L 蛋白酶 K，混匀， 56保温 5min。（5）剧烈震荡 10s,沸水浴 8min。（6）10000r/min 离心 3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为 Chelex100 和细胞碎片的沉淀，上层溶液含 DNA 分子，可以直接用作 PCR 模板。此 DNA 样本可在 4或-20保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。2
26、PCR 扩增 D1S80 等位基因（1）每个人用记号笔在 0.2mL PCR 管上做好标记。（2）准备冰盒，开始反应前尽量使 PCR 管保持在冰上。（3）依次加入下列成分，配制 25L 体系的 PCR 反应溶液：PCR pre-mix 12.5L引物 1 1L引物 2 1L口腔细胞 DNA 样本 10L10加无菌水至总体积 25uL。（4）轻弹管壁，混匀溶液。（5）离心 10s，使管壁上的液滴落下。（6）按下列程序开始 PCR 反应：94，1min94，15s68，15s72，15 s30 个循环72，10min4暂时放置，直至开始电泳3PCR 扩增产物鉴定与 D1S80 等位基因分析（1）用
27、 1TAE 电泳缓冲液配制 2.0%琼脂糖电泳凝胶。（2）60V 预电泳 12min。（3）在凝胶上选一孔加入 6L 的 DNA 相对分子质量标记（DNA100bp Ladder） 。（4）每位同学将各自的 20LD1S80 PCR 扩增产物加入指定凝胶样孔，注意不要有气泡进入。（5）60V 电泳 40min-50min。（6）取出凝胶用清水漂洗。（7）用紫外分析仪观察凝胶，记录每个个体的 DNA 条带数目及其位置。【结果与分析】本次实验所选择的方法是 D1S80 指纹图谱分析的常用方法。人群中 D1S80 座位的杂合率约为 86。从理论上讲，可能存在 435 种不同的等位基因组合。利用 D1
28、S80 座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990） ，通过 PCR 反应，很容易确定特定个体的 D1S80等位基因构成，纯合体只有一条 DNA 带，而杂合体有两条不同的 DNA 带。1 将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp） 。（见附图）2 根据电泳结果，填写 D1S80 等位基因分析结果（表 7-1）：D1S80 DNA 指纹特征学生姓名 大小/bp 长度（重复数） 杂合/ 纯合小组成员 A 460 19.688 杂合小组成员 A 380 14.688 杂合小组成员 D 590 27.812 杂合小组成员 D 480 20.938 杂合表 7-1 结果记录表注：因为重复数为 l 的 DIS80 PCR 产物长 161bp，所以，重复数每增加一个，序列增加长度 16 bp。据此可以催算：重复数=1+（PCR 产物大小161 ）/163在班级中调查有无同学 D1S80 指纹图谱完全相同或部分相同。自行查找有关人群中
