1、本科毕业论文（20 届）MBR 系统中产高丝氨酸内酯的细菌的筛选及鉴定所在学院专业班级 水土保持与荒漠化防治学生姓名指导教师完成日期目 录摘要 .1关键词 .1Abstract.11 引言 .22 材料与方法 .32.1 材料 .32.1.1 菌株 .32.1.2 培养条件 .42.2 实验试剂和设备 .42.2.1 实验试剂 .42.2.2 实验仪器 .42.3 MBR 反应器 .52.3.1 模拟废水组成 .62.3.2 膜反应器的运行 .62.4 MBR 生物膜中细菌的分离 .62.5 细菌 AHL 信号因子的测定 .72.6 产生 AHL 信号因子细菌鉴定 .73.结果与分析 .73.
2、1 膜生物反应器的处理效果 .73.1.1 膜生物反应器中 COD 去除特性 .83.1.2 膜生物反应器中 NH3-N 去除特性 .83.2 膜生物反应器的通量行为 .93.3 MBR 生物膜中细菌的分离 .103.4 细菌 AHL 信号因子的测定 .113.5 产 AHL 信号因子细菌鉴定 .124.结论 .13参考文献： .14致 谢 .151摘要: 膜生物反应器(MBR)对模拟生活污水有良好的处理效果，系统总COD及氨氮的去除率均达到87%以上。但随着反应器的运行，系统中膜污染不断加剧， 15天后，需对膜组件进行清洗。为研究膜污染机理与群体感应的联系，利用紫色杆菌CV026 ( Chr
3、omobacterium violaceum CV026)为报告菌，建立平板交叉换线法从膜生物反应器（MBR）模拟生活废水系统中分离、筛选出3株能够分泌群体感应信号因子高丝氨酸内酯（AHL）的细菌，分别命名M10、N27和N34。对它们进行个体形态和16S rDNA 序列进行分析，初步鉴定分别为Chromobacterium violaceum、Aeromonas hydrophila和Aeromonas aquariorum。关键词:膜生物反应器（MBR) 群体感应 高丝氨酸内酯 筛选 鉴定Abstract：he Membrane Bio-Reactor(MBR) showed an exc
4、ellent treatment effect for the municipal synthetic wastewater. Both the removal rates for the COD and NH3-N were above 97%. As the running of the MBR, membrane fouling was increased rapidly. The membrane should be cleaned after 15 days. In order to detect N-acylated homoserine lactones(AHLs) which
5、were known as signal molecules of quorum sensing，a bioassay was developed based on the production of pigments by Chromobacterium violaceum CV026. Using cross-feeding assay，3 strains which can product AHLs, were isolated from the Membrane Bio-Reactor system with municipal synthetic wastewater. The 3
6、isolated strains were named M10, N27 and N34, respectively. Based on the morphology and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, M10, N27 and N34 were identified as Chromobacterium violaceum, Aeromonas hydrophila and Aeromonas aquariorum.Key words： Membrane Bio-Reactor(MBR）、quorum sensing、N-acyla
7、ted homoserine lactone、Screening, identification 21 引言膜-生物反应器（Membrane Bio-Reactor,MBR）为膜分离技术与生物处理技术有机结合之新型态废水处理系统。以膜组件取代传统生物处理技术末端二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥浓度，提高生物处理有机负荷，从而减少污水处理设施占地面积，并通过保持低污泥负荷减少剩余污泥量（主要利用膜分离设备截留水中的活性污泥与大分子有机物） 。膜生物反应器因其有效的截留作用，可保留世代周期较长的微生物，可实现对污水深度净化，同时硝化菌在系统内能充分繁殖，其硝化效果明显，对深度除磷脱氮提供可能。
8、我国水资源的人均占有量仅为世界人均的 1/4，是世界人均水资源极少的 13 个贫水国之一 1。与此同时，我国又是世界上污水排放量最大，污水排放增加速度最快的国家之一。 ，全国 7 大重点流域地表水均存在着污染，特别是流经城市的河段污染严重 2。因此 MBR 工艺在我国受到了越来越多的关注，我国从 20 世纪 90 年代开始对膜生物反应器进行研究，通过十几年的精心研究与试验，现已取得了重大的成果。如郑宏林、朱家民 3等列举了 MBR 技术在污水资源化中推广应用的制约因素；罗虹，顾平，杨造燕 4测定了投加粉末活性炭对膜阻力的影响邢锴，张宏伟，龙树勇 5等对好氧颗特污泥在膜生物反应器中膜污染的特性进
9、行了研究。MBR 技术在我国逐渐得到广泛的应用，而且也已有数座日处理量大于万吨的 MBR 系统正式投入运行。实践证明，MBR 技术能成功地应用于城市生活污水和工业废水的处理，尤其是对一些高浓度有机废水(如食品废水、啤酒废水等)和难降解工业废水(如印染废水、石化废水等)的处理，MBR 确实有着特殊的功效。从长远的观点来看，由于 MBR 工艺的这些明显优点，它在污水处理中的应用必将越来越广。然而在工程实践中，膜污染问题却一直影响着该技术的推广与应用。所谓膜污染是指处理物料中的微粒、胶体颗粒以及溶质大分子由于与膜存在物理、化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附和沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜
10、通量及膜的分离特性产生变化的现象 6-8,MBR 中膜的污染主要分为有机型、无机型及生物型三大类，其中生物型污染被认为是污水膜处理过程中的最重要问题之一 9-10。膜生物污染是指微生物在膜-水界面上积累，从而影响系统性能的现象,膜污染速率随着泥龄的降低而增加。膜组件内部潮湿阴暗，是一个微生物生长的理想环境，所以一旦原水的生物活性水平较高，则极易发生膜的生物污染,段亮 11通过构建 3 个不同泥龄的小试MBR，研究泥龄对 MBR 的运行效果、膜污染及微生物群落等方面的影响,结果表明膜污染速率随着泥龄的降低而增加。膜的生物污染分两个阶段：粘附和生长。在溶液中没有投入生物杀虫剂或投入量不足时，粘附细
11、胞会在进水营养物质的供养下成长繁殖，形成生物膜。在一级生物膜上的二次粘附或卷吸进一步发展了生物膜。老化的生物膜细菌主要分解成蛋白质、核酸、多糖酯和其它大分子物质，这些物质强烈吸附在膜面上引起膜表面改性。被改性的膜表面更容易吸引其它种类的微生物。微生物的一个重要特征是它们具有对变化营养、水动力或其它条件作出迅速生化和基因调节的能力。因此，生物污染3问题比非活性的胶体污染或矿物质结垢更为严重。已有的研究表明，从浮游状态到形成生物膜，微生物经历了从低密度到高密度、从无组织到有组织状态的过程，其中群体感应机制（quorum sensing，QS）在此过程中发挥着重要作用 12。群体感应是一种普遍存在于
12、微生物细胞与细胞之间的依靠信号物质传导的信息交流机制，它使单细胞微生物之间能够在“群体水平”上“相互协作” ，完成一些单细胞无法进行的生物过程，包括形成生物膜。Teresa 等 13 研究发现，铜绿假单胞菌中存在 las 和 rhl 两类群体感应系统，对生物膜的发育和许多毒性因子调控方面起到重要作用。存在于细菌中的群体感应系统复杂多样，因信号分子的不同而不同。从文献报道看，目前倍受关注且研究最为深入的是广泛存在于革兰氏阴性细菌的酰基化高丝氨酸内脂(Acyl-homoserine lactone, AHL)信号分子介导的群体感应系统。而且，此类信号分子及其生成菌株也被国内外学者在不同的生物膜环境
13、中得到了分离。McLean 等 14证实了自然条件下形成的生物膜存在着 AHLs 类自诱导物。李蒙英等 15在硝基苯甲酸废水处理系统的生物膜中分离得到两株产生 AHLs 类信号分子的菌株，并且这种菌株都存在一定的成膜能力 16 。黄妙琴等 17 通过实验发现，在分离获得的 43 株海洋细菌中 AHLs 化合物活性菌株( 10 株) 90% 有很强的生物膜形成能力，并常能形成较大的细胞团。故研究AHL 所介导的群体感应系统在生物膜形成中所起的调控作用，具有重要的普遍意义与应用价值。Yeon KM, Cheong WS18通过 AHL 报告菌 Agrobacterium tumefaciens A
14、136 (pCF218)(pCF372)证实 MBR 污水处理系统中确实存在着群体感应现象，并且对膜污染的形成有一定关系。但目前的研究对 MBR 膜生物污染的群体感应现象及功能的了解还不深入，而要进一步了解群体感应对膜生物污染的复杂的调控作用、揭示膜生物污染的机制、解决 MBR的膜污染问题，必须对具有群体感应的细菌进行深入了解掌握这类细菌的生物学能力及成膜机理。因此，本研究以模拟生活污水为对象，考察 MBR 对其中污染物的去除能力，以及膜污染层的形成。并从 MBR 废水处理系统生物膜中分离出能够产生高丝氨酸内酯（AHL）信号分子的细菌并对其进行鉴定，为生活污水 MBR 处理系统中细菌的群体感应
15、可能参与调控的生物膜形成等功能研究及 MBR 膜污染预防和控制提供理论依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株McClean 等 19 采用转座子插入突变法破坏紫色色杆菌( Chromobacterium 4violaceum) AHLs 合成酶基因 cviI 和紫色色杆菌素合成抑制基因而构建的紫色色杆菌突变株 CV026( Chromobacterium violaceum CV026)本身不产生 AHLs，也不产生紫色，但是当外源 AHLs 存在时，它会产生特征性的紫色，是理想的生物感应器。所以本实验用紫色色杆菌 CVO26 由美国 Texas State University 的
16、 R.J.C. Mclean 教授 20馈赠，作为指示菌来检测是否有 AHLs 的产生。2.1.2 培养条件本实验使用 LB 培养基对细菌进行培养，其中紫色杆菌 CVO26 的培养基需加入20g/mL 卡那霉素。配制每升 LB 培养基,应该在 950 ml 去离子水中加入:胰化蛋白胨 10g ，酵母提取物 5g ， NaCl 10g 。摇动容器直至溶质溶解.用 5mol/L NaOH 调 pH 至 7.0，用去离子水定容至 1L. 每升的 LB 固体培养基，需在液体培养基的基础上加 15g 琼脂粉，并加热沸腾时琼脂均匀溶解。固体培养基应待培养基温度降到 55左右（手可触摸，但又未凝固时）加入抗
17、生素。液体培养基，可在接菌前再加入抗生素。2.2 实验试剂和设备2.2.1 实验试剂(胰化)蛋白胨、酵母膏、NaCL、NaOH、HCl、葡萄糖、CaCl2、NaHCO 3、MgSO 47H2O、KH 2PO4、NH 4CL、卡那霉素、酒精2.2.2 实验仪器剪刀 培养皿 试管 接种环 烧杯 试剂瓶 保菌管 离心管 锥形瓶、涂布棒电子天平 ALB-124 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司电子天平 YP502N 上海精密科学仪器仪器有限公司实验室 PH 计 FE20 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司电热蒸馏水器 YN-ZD-2 上海博讯实业有限公司医疗设备厂超净工作台 SW-CJ-1FD 苏净集团
18、苏州安泰空气技术有限公司生化培养箱 SPX-250B-Z 上海博迅实业有限公司医疗设备厂移液枪 20-200l 赛默飞氏尔（上海）仪器有限公司移液枪 100-1000l 赛默飞氏尔（上海）仪器有限公司移液枪 1000-5000l 赛默飞氏尔（上海）仪器有限公司蒸气灭菌器 LDZX-50KB 上海申安医疗器械厂恒温培养振荡器 ZHWY-211B 上海智城分析仪器制造有限公司5鼓风干燥箱 101-1-BS- 上海跃进医疗机械厂冰箱 BCD-202K 容声水质参数仪 5B-3B2.3 MBR 反应器试验采用膜生物反应器装置如图 1，主体反应器为矩形有机玻璃容器组成，有效容积为 40 L，采用平板膜为
19、膜主件。 图 1 膜生物反应器试验装置1进水桶；2进水泵；3反应器自动控制柜；4生物反应器；5曝气泵；6微孔曝气管；7出水泵；8出水；9液位器；10中空纤维膜 6图 2 MBR 反应器2.3.1 模拟废水组成试验用水采用人工配制的生活废水 14, 具体水质情况如表 1表 1 模拟废水组成(mgL -1)组成 含量 组成 含量葡萄糖 360 10 CaCl2 18 3蛋白胨 80 5 MgSO47H2O 24 3NaHCO3 24 5 NH4Cl 60 5KH2PO4 14 52.3.2 膜反应器的运行膜生物反应器在室温下运行，接种污泥取自福州祥坂污水处理厂。反应器以恒定通量的方式运行，通过改变
20、出水抽吸压力使膜通量维持在恒定值。初始压力设为 0.1MPa，间歇出水，以跨膜压差（Trans-Membrane Pressure, TMP）来表示膜污染情况。随着反应器的运行，定期取反应器出水、反应器内上清液和污泥样品，测定 COD、氨氮、PH 值、污泥浓度等指标。反应器运行参数如表 2表 2 膜生物反应器运行条件参数 参数值 参数 参数值进水（Lm -2h-1） 5 0.5 DO(mgL-1) 3.5 0.5出水（min） 出水 10，停 5 COD(mgL-1) 300 150HRT（h） 24 1 SS(gL-1) 15 2SRT（天） 不排泥 pH 7.4 0.4温度（） 2552.
21、4 MBR 生物膜中细菌的分离在反应器运行稳定后，进行生物膜上细菌的分离第一、菌原液制备取出 MBR 的膜，用镊子夹取灭菌纱布，刮下膜表面吸附的菌及反应器壁上所粘的菌，7将纱布投入一定量的无菌水中，混匀，备用。第二、梯度稀释取试管若干，用吸液枪吸取无菌水 9ml 于试管中。吸取菌原液 1ml 加入 9ml 无菌水中，制成 10-1稀释液。用以上方法对前面制成的稀释液进行再次稀释，如此反复 5 次，制成 10-6稀释液。第三、涂布选取稀释度为 10-310-6 的菌液涂布于 LB 平板培养基，每个浓度涂 3 个板，涂布时从低浓度开始，涂布时吸取菌液量为 100uL。第四、划线纯化待板上菌落长出后
22、，根据菌落形态(形状,大小,隆起程度,透明程度,边缘形状和菌落颜色的差别)挑取高度分散的单菌落，划线纯化 2-3 次直至得到单一菌株。经纯化的菌株分别放于-80和 4下保存备用。2.5 细菌 AHL 信号因子的测定以 C violaceum CV026 作为报告菌，利用平板交叉划线法能够有效地检测细菌产生AHLs，故可用于筛选能够产生 AHL 信号因子的细菌。C violaceum CV026 主要能够检测短链的 AHLs，筛选出的细菌能够产生 C4 和 C6-AHLs。将报告菌 C violaceum CV026 在相应培养基上活化后，将报告菌与待检菌“T”字型划线接种于 LB 平板上放置于
23、培养箱中培养。过夜培养后，观察平板上颜色的变化，如果报告菌在靠近待测菌的地方产生紫色变化，说明该细菌能够产生 AHL 信号因子诱导C violaceum CV026 产生紫色色素。2.6 产生 AHL 信号因子细菌鉴定挑取菌体于 50L TaKaRa Lysis Buffer 变性后离心取上清液作为模板。反应条件:80 ，15min 。使用 TaKaRa 165 rDNA Bacterial Identification PCR Kit 进行 PCR扩增目的片段。PCR 扩增步骤：预变性，94 5 min；循环条件为 94 1min，55 1min , 72 1.5min，30 次循环，最后
24、72 延伸 5min。将 PCR 产物送到大连宝生物工程有限公司进行序列测定将测定的序列通过 Genbank 数据库中 BLAST 进行序列对比分析，选取若干相似度较高的菌株的 16S rDNA 序列，通过 ClustaLX1.8.3 和 MEGA6.0 建立系统发育树。3.结果与分析3.1 膜生物反应器的处理效果8以模拟生活废水对膜生物反应器进行稳定性驯化，当反应器处理稳定状态后，以 15 天为一个运行单元，对膜生物反应器出水水质与曝气池上清液水质进行同步监测，分析反应器的运行情况及微滤膜对 COD、氨氮去除的贡献。3.1.1 膜生物反应器中 COD 去除特性图 3、图 4 为反应器运行期间 COD 去除情况。从图中可知，反应器出水 COD 稳定在3040mg/L，系统的总 COD 去除率保持在 88%左右。从图 3 中可看出，反应器中上清液的 COD 始终大于出水 COD 浓度，这说明除污染微生物的分解作用外，膜生物反应器中膜的拦截作用也会导致系统的 COD 浓度下降。而通过计算表明，本研究中膜的拦截作用负担了约 10%15%的 COD 去除。图 3 COD 随时间变化曲线图 4 COD 去除率随时间变化曲线
