1、,Gen-Probe分枝杆菌快速检测仪,分枝杆菌 :用Gen-Probe 产品检测程序和时间,Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型,扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌: AMPLIFIED MTD ( Gen-Probe) 临床痰标本(涂阳或涂阴)杂交检测分枝杆菌: ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性标本 (菌落或肉汤),MTD (AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct) 检测,结核分枝杆菌复合菌: M.tuberculosis 结核分枝杆菌M.bovis 牛分枝杆菌 M.bovis BCG 牛分枝杆菌BCGM.africanum
2、非洲分枝杆菌 M.microti 田鼠分枝杆菌 M.canetti 卡氏分枝杆菌,Gen-Probe MTD检测,以16S rRNA 为靶核酸TMA ：转录介导扩增 HPA：杂交保护分析,RNA与 DNA,DNA非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结构 RNA只存在于活细胞非常脆弱 (RNA容易受破坏)单链结构,结核菌核酸,RNA是DNA的4-5倍rRNA占80%,Gen-Probe 扩增,3 个主要步骤 标本处理 释放 rRNA TMA rRNA 扩增物 HPA 检测扩增物,超声波裂解,样品,细胞溶解,目标 rRNA 释放,TMA转录介导扩增,2条引物： 2种酶： *逆转录酶(双功能:逆转录和
3、RNAse H酶) (RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有作用) *RNA聚合酶等温扩增：42,逆转录酶,TMA原理,敏 感,10 000 拷贝rRNA,DNA,RNA 聚合酶,(eg : E.coli),扩增产物检测：HPA技术,HPA：杂交保护分析技术 标记丫啶酯（Acridinium ester）的DNA 探针与 RNA 扩增产物杂交，形成DNA：RNA双螺旋结构保护荧光物丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。,HPA 步骤,丫啶酯标记的特异 DNA探针与RNA扩增物杂交使用生化水解方
4、法，分离杂交及未杂交探针检测：化学发光检测 试剂1：0.001N硝酸中含0.1%过氧化氢； 试剂2：1N NaOH,杂 交,60,杂交,rRNA,探针,杂交温度的影响,60,61,59,非特异结合,无杂交,假阴性高,假阳性高,选 择,60,选择试剂,CH3,N+,O,O,R,H2O2 / OH-,light,检 测,敏 感 度 比 较,化学发光10-19 mole辐射同位素 10-18 mole荧光 10-12 mole比色 10-9 mole,总 结,靶核酸: rRNA等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶(RNAse H)、RNA 聚合酶）扩增原理：TMA（转录介导扩增）液相杂交：HPA（杂交保
5、护分析）化学发光法：检测杂交信号,MTD 方法,STEP1：标本预处理 超声波降解标本STEP2：扩增 (TMA) 扩增试剂, 石腊油，经过预处理的标本-消化 95 , 15 分钟，水浴 42 , 5 分钟-加入酶试剂，扩增 42 , 30 分钟STEP3：探测 ( HPA) 加入探针试剂-杂交 60, 15 分钟-选择 60 , 15 分钟-在发光仪读数,扩增 : TMA加入试管 :扩增试剂, 石腊油 经过预处理的标本 消化 95 , 15 分钟 水浴 42 , 5 分钟加入 酶试剂扩增 42 , 30 分钟,标本预处理 :准备并（超）声波降解标本,探测 : HPA加入探针试剂杂交 60, 15 分钟选择 60 , 15 分钟在发光仪读数,
