1、电离辐射的细胞和组织效应,中国医学科学院肿瘤医院放疗科杨伟志,临床放射生物学在放射治疗中的作用和地位,“生物学”与“医学”“微观”与“宏观”“经典理论”的现实意义,临床放射生物学在放射治疗中的作用和地位,从实验室到临床的桥梁提供理论基础，阐述放射治疗的生物学原理治疗策略及验证个体化放射治疗方案的研究和设计,一 辐射生物效应的时标:(The time-scale of effects in radiation biology) 不同水平生物效应的发生时间、顺序、过程（细胞死亡需数天到数月，辐射致癌作用需数年，可遗传的损伤需经数代才能观察到,物理吸收过程（10-15秒内结束）。化学过程（DNA残基
2、的存在时间10-3 到10-5）秒）。生物学过程,二.电离辐射的直接作用和间接作用,电离辐射的直接作用任何形式的辐射，X （）射线，带电或不带电粒子被生物物质吸收后都可能与细胞的关键靶DNA直接发生作用， DNA本身的原子可以被电离或激发从而导致一系列生物变化的事件，这被称为辐射的直接作用。高LET射线（如中子、粒子）主要是直接作用,电离辐射的直接作用和间接作用,电离辐射的间接作用辐射也可与细胞内的其它原子或分子（特别是水）相互作用，产生自由基，这些自由基可以扩散到足够远，达到并损伤关键靶DNA，这被称为电离辐射的间接作用。自由基是一种游离的原子或分子，外层携带不成对轨道电子。,从入射光子的吸
3、收到最终生物效应的产生，X射线的间接作用：,入射X射线光子 | 快速电子 | 离子自由基(H2o H2o+ + e) | 自由基(H2o+ + H2o H3o+ +OH ) | 高活性 由化学键断裂引起的化学变化 | 生物效应,OH,插图,三.电离辐射的细胞效应,分子水平DNA链损伤DNA链修复细胞水平,电离辐射的细胞效应,辐射诱导的DNA损伤及修复研究显示：DNA是引起一系列生物学效应的关键靶。DNA链断裂的主要形式单链断裂 双链断裂,插图,电离辐射的细胞效应,DNA链断裂的修复DNA单链断裂的修复以对侧链为模板，是一种可完全修复的分子损伤DNA双链断裂的修复可修复的双链断裂（彼此分开间隔一
4、段距离）不可修复的双链断裂（发生在对侧互补碱基或仅间隔几个碱基对-染色体折成两段）,电离辐射的细胞效应,DNA双链断裂的修复两个基本过程同源重组（Homologous recombination) 在修复中需要未受损的DNA链参与，末端与末端经非同源重组相接。非同源重组（nonhomologous(Illegitimate) recombination没有模板存在，无法指导缝隙的填充。因此容易发生错误。所以也称之为非法重组,插图,电离辐射的细胞效应,辐射所致的细胞死亡.两种主要形式分裂间期死亡（细胞在进行下一次分裂前死亡）有丝分裂死亡 (增殖性死亡）指由于染色体的损伤，细胞在试图分裂时发生死亡
5、。死亡可发生在照射后的第一次或以后的几次分裂。是电离辐射引起细胞死亡的最常见形式，,电离辐射的细胞效应,辐射引起细胞死亡的关键靶在细胞核放射性同位素（如3H,125I）掺入核DNA可有效地造成DNA损伤并杀死细胞。受放射线照射后染色体畸变率与细胞死亡密切相关。当特异地把胸腺嘧啶类似物，如碘脱氧尿核苷或溴脱氧尿核苷掺入染色体时可修饰细胞的放射敏感性,电离辐射的细胞效应,放射生物对细胞死亡的基本认识：一般意义的细胞死亡（cell death)，细胞再繁殖完整性的丢失(loss of reproductive integrity of tumor cells)两者在概念上存在着根本意义上的不同，放射
6、可治愈性结局的最主要依据是后者。放射治疗对受照射后的存活细胞更加关注，因这对放射可治愈性非常重要,细胞存活曲线描述放射线照射剂量和细胞存活比之间的关系，关注的是：一定剂量照射以后对克隆源细胞而不是细胞群任意细胞的杀灭,电离辐射的细胞效应,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线放射生物学规定：鉴别“细胞存活”的唯一标准是照射后细胞是否保持再繁殖的完整性，即所分析的是克隆源细胞的增殖活性而不是受照射群体中任意细胞的功能活性MTT法、染料除外等方法均不被认可,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线克隆源细胞（clonogenic cell)指具有生成“克隆”能力的原始存活细胞。在离体培养细胞：这种无限增殖能力体
7、现为形成一个完整的50个细胞的克隆在体内：体现为肿瘤体积的不断增大、复发、转移在这个“细胞存活”的严格定义下，提示临床必须重视这种存活细胞，这种具有无限增殖能力的细胞是在治疗中必须根除的细胞,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线细胞形成克隆的能力被称为“细胞存活”辐射所致的细胞杀灭是指数性的，指数关系的特点：增加一定剂量就有一定比例的细胞而不是数量的细胞被杀死,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线主要实验方法和步骤细胞培养，- 指数生长期或相对密度生长期（平台期）测定细胞系的克隆形成率（Plating efficiency,PE)测定照射后细胞的存活分数(survivingfraction,SF)根据
8、各照射剂量点的存活分数作图绘制细胞存活曲线，计算曲线参数,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线实验设计原则及注意事项实验所采用的细胞系应具有一定的克隆形成率（50-90%）应设6-8个照射剂量点，肩区点要够（应包括0，1Gy,2Gy)，以保证低剂量区效应的准确性,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线根据细胞类型，高剂量区的终末剂量点应够大，是细胞杀灭达到一定数量级根据细胞周期时间确定合适的培养时间（9-14天），培养时间过长细胞会因营养不良而脱落,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线克隆培养用容器不应太小（不赞成使用孔板和扩散盒等），以60-100mm平皿最常用，容器太小所能容纳的细胞数不足以达到上述标准
9、，且难以分散均匀。克隆形成期间不能换液，以保证克隆形成的准确性。,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线应计数大于50个细胞以上的克隆选择合适的数学模型进行曲线拟合，应注意不同模型间的参数不能互用实验结果的分析只能采用存活曲线参数间的比较，不能用单剂量点存活分数直接比较（因放射生物分析的是产生相等效应所需的照射剂量，不是相同剂量产生的效应差别）,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线细胞存活曲线的形状指数存活曲线 对于致密电离辐射（如中子、粒子），照射后细胞存活曲线用单靶单击数学模型拟合后，在半对数坐标上是一条直线，呈指数型。非指数存活曲线 对稀疏电离辐射（射线、射线等），照射后细胞存活曲线的起始部（低剂
10、量段）在半对数坐标上有一个有限的初斜率，在肩段存活曲线出现弯曲，在高剂量段存活曲线又趋于直线,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线指数存活曲线的数学模型单靶单击模型（single-hit multi-target model)数学表达式：SF=e-De为自然对数的底； 为与射线的质及放射敏感性有关的常数曲线参数：D0 平均致死剂量,电离辐射的细胞效应,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线线性二次模型（linear-quadratic model)线性二次模型假设，辐射杀灭细胞有两部分，一部分与照射剂量成比例，另一部分与照射剂量的平方成比例。数学表达式S = e-D-D2S是照射剂量为D时的细胞存活，
11、和是常数。,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期的基本概念一个世纪以前，人们已了解到多细胞动物细胞繁殖的基本机制是有丝分裂哺乳动物细胞通过有丝分裂繁殖和传代一个细胞分裂时会产生2个子细胞（每个子细胞都携带一套与母细胞完全相同的染色体两次有效的有丝分裂之间的时间，称为细胞周期。,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期、时相显微镜观察（早期） -有丝分裂期细胞 分裂间期细胞放射自显影术（1953）- 细胞周期时相细胞光度术（1948）流式细胞术 - 细胞周期时相,细胞周期时相,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期中不同时相细胞的放射敏感性有丝分裂细胞或接近有丝分裂细胞最放射敏感（G2和M期的细胞是最放射敏
12、感的）晚S期的细胞通常具有较大的放射耐受性若G1期较长，G1早期较G1晚期相对放射耐受（G2期细胞在分裂前没有充足的时间修复放射损伤）,Sinclair和Morton（1965）,不同周期时相仓鼠细胞的放射敏感性变化,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期再分布的意义一般认为，分次放射治疗中存在着处于相对放射抗拒时相的细胞向放射敏感时相移动的再分布现象，这有助于提高放射线对肿瘤细胞的杀伤效果。如果未能进行有效的细胞周期内时相的再分布，则也可能成为放射抗拒的机制之一。,四.电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的增殖动力学肿瘤的细胞动力学层次(cell kinetic compartments of a t
13、umor) 根据动力学特性分4个层次：第一层次：由活跃分裂的细胞组成(也称“P”细胞）所有细胞都将通过细胞周期可用细胞标记技术进行辨认该层次细胞在整个肿瘤细胞群体中所占的比例成为生长比例（growth fraction, GF),电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的增殖动力学第二层次 由静止（G0)细胞组成非增殖细胞的层次(Q细胞或静止细胞）G0细胞可再进入细胞周期有些G0细胞是克隆源细胞（可再群体化出一个肿瘤）第三层次由分化的终末细胞组成不再具有分裂能力第四层次 由死亡和正在死亡的细胞组成细胞从一个层次向另一个层次的转化是连续发生的Q层次向P层次的移动成为再补充（recruitment),电离辐
14、射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度描述肿瘤生长速度的3个参数：1.肿瘤的体积倍增时间（tumor volume doubling time,Td )由3个主要因素决定：细胞周期时间（the cell cycle time)生长比例 (the growth fraction)细胞丢失速率（the rate of cell lose),电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度2.潜在倍增时间（potential doubling time,Tpot)指假设在没有细胞丢失情况下肿瘤细胞群体增加一倍所需的时间（Steel ,1977)。 Ts Tpot = _ LI Ts：s期持续时间，LI：标记指数
15、， ：校正系数（0.7-1.0）,电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度3.细胞丢失因子（cell loss factor) Tpot 细胞丢失因子 = 1 - Td许多人肿瘤生长较慢，主要是因为细胞丢失率高。细胞丢失的主要机制：坏死 分化,肿瘤生长速度,人肿瘤典型的动力学参数 -细胞周期时间（-2天）生长比例 （-40%） 潜在倍增时间（-5天）细胞丢失 （-90%） 体积倍增时间 （-60天）-,电离辐射对肿瘤组织的作用,放射治疗中的剂量-效应关系剂量-效应关系的概念指即定物理吸收剂量与放射生物效应结果及影响因素之间的关系。我们在临床上所看到的是一个广泛的剂量范围，在这个范围特定类型放射
16、反应的风险随照射剂量的增加从0%-100%，,电离辐射对肿瘤组织的作用,放射治疗中的剂量-效应关系剂量-效应曲线的形状电离辐射的剂量-效应曲线呈“S”形随剂量趋于“0”，辐射效应的发生率也趋于“0”在高剂量时辐射效应趋于“100%”,剂量-效应曲线的形状,电离辐射对肿瘤组织的作用,放射治疗中的剂量-效应关系描述剂量-效应曲线的3个标准模式有许多数学公式被设计用于描述电离辐射剂量效应关系的这种特性，但只有3个标准模式作为TCP和 NTCP公式的基础被使用着。泊松剂量-效应模式（The poisson dose-response model)逻辑剂量-效应模式(The logostic dese-
17、response model)概率剂量-效应模式(The probit dose-response model),五.从在体实验肿瘤的放射生物学研究中得出的一些结论,肿瘤的体积效应大肿瘤比小肿瘤难治（主要是需要杀灭的克隆源细胞数多）。疗程结束克隆源细胞的存活比约10-9时可以治愈在大肿瘤中的克隆源细胞对治疗的敏感性更小,从在体实验肿瘤的放射生物学研究中得出的一些结论,再群体化加速1969年，Hermens 和Barendsen即已指出：那些在照射中存活下来的克隆源细胞可以使肿瘤很快再群体化。,加速再群体化。 大鼠横纹肌肉瘤的生长曲线，A.曲线1是未照射的对照组的生长曲线；曲线2是照射后即刻的肿
18、瘤生长曲线；B. 照射以后不同时间克隆源细胞的比例变化。,单次20Gy X射线照射后大鼠移植瘤肿瘤消退和再生长的总生长曲线。值得重视的是，在这段时间里肿瘤还在明显皱缩和消退着，而存活克隆源细胞的分裂数目比以前更多更快。,从在体实验肿瘤的放射生物学研究中得出的一些结论,瘤床效应治疗后复发的实验肿瘤生长速度比原发的慢，称之为瘤床效应把肿瘤接种到受过照射的皮下组织部位，肿瘤生长速度减慢瘤床效应由照射对间质组织的损伤所致,从在体实验肿瘤的放射生物学研究中得出的一些结论,乏氧和再氧合研究表明，大多数肿瘤存在乏氧细胞。乏氧细胞对放射线及许多化疗药耐受。常规照射是通过分次照射诱导的乏氧细胞再氧合来克服肿瘤乏氧的 。“乏氧细胞的显像”研究及“生物适形”研究是目前研究的热点。,THANKYOU,
