1、实验三 小白鼠骨髓染色体制备及观察,1、实验目的与要求 掌握动物骨髓细胞染色体制备技术 学会动物细胞的滴片方法 观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目,2、实验原理, 小鼠骨髓细胞 秋水仙素可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成，把分裂细胞阻截在中期。 通过对小鼠骨髓细胞的低渗、固定、滴片、染色等处理，可观察到小鼠染色体。 这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易，不需无菌条件，方便易行。,3、实验材料,实验动物健康小鼠(Mus musculus 2n=40)，体重约1820g，雌雄不限。 试剂 甲醇、冰乙酸、石炭酸品红、秋水仙素、KCl、生理盐水,3、实验材料,实验器材恒温培养箱、普通离心机、显微
2、镜、分析天平、离心管(510 mL)、吸管注射器(5 mL)、100 mL烧杯、载玻片 （冰片）,3、实验材料,溶液配制：(1)0.01秋水仙素：称10 mg秋水仙素，溶于100 mL生理盐水中。(2)低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000 mL蒸馏水中，其浓度为0.075M。2%柠檬酸钠溶液：称2.28克柠檬酸钠溶于100ml蒸馏水中。Giemsa溶液,4、实验方法,主要实验步骤 秋水仙素注射 解剖小鼠 离心 低渗 固定 制备细胞悬浮液 滴片 空气干燥 染色 水洗 显微镜观察结果,方法与步骤,取材前34 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞
3、阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。,腹腔内注射秋水仙素34小时后，断头处死小鼠。,取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。,滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等组织清除干净。,加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓细胞全部释放出来。,亦可用注射器抽取柠檬酸铵溶液冲洗骨髓，效果佳,将获得的液体收集到离心管中，离心后去上清液，加低渗液至8ml左右，室温下静置2030分钟，进行低渗。低渗结束后，加入1ml左右的Carnoys固定液进行预固定，轻轻混匀后，离心。,1000转/分，离心10分钟，弃上清，加入固定液，混匀后，室温放置25分钟，
4、再次离心去上清，重复固定一次，离心后，向沉淀中加入1ml固定液，将细胞重悬。,预冷的玻片,滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色1015分钟，弃去染液，水洗，镜检。,实验结果,苯酚品红染色效果,结果显示,在显微镜寻找分散良好的中期分裂相。小白鼠染色体一般呈“U”形，都为近端着丝粒染色体。染色体数2n=40。图示为吉姆萨染色效果,5、实验结果与分析讨论,绘制小鼠骨髓细胞染色体图 统计小鼠染色体数目如果有条件时，要进行显微摄影，然后进行组型分析,使用柠檬酸钠的原因： 在临床上采取新鲜血液时,需要加入一些消毒过的柠檬酸钠,就能起到防止血液凝固的作用,所以柠檬酸钠被称为抗凝血剂。 枸橼酸根与
5、血中钙离子形成难解离的络合物，钙离子是凝血过程中所需的物质之一，血液中钙离子减少，而使血液凝固受阻。,低渗的作用： 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37，1525分钟，以预实验条件为准。,思考题,1KCl溶液低渗处理与滴片过程在染色体制片中有何联系，对制片结果各有何影响？2骨髓细胞染色体标本制作时，为什么要采用冰片滴片？冰片滴片时滴液高度有什么要求？为什么滴片后要马上吹散？冰片温度为什么越冰越好？,
