1、利用流式细胞仪( flow cytometer ) 通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。 & 检测表面标记物 & 检测胞浆标记物 & 检测胞核内标记物 & 检测可溶性蛋白,流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）,一、流式细胞仪的原理应用技巧的基础,1、仪器的基本原理,光源：激光(488nm 氩离子空冷激光) 细胞： 单细胞悬液 液流：鞘液(Sheath Fluid) 流动室：Flow Cell检测器：光电倍增管(PMT)检测信号：散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1FL4)统计分析：计算机,散射光信号 FS 细
2、胞大小 SS 细胞颗粒性荧光信号 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5 - PC7,用荧光标记抗体,抗体特异性地结合细胞上对应的抗原,表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强,阳性细胞百分比或浓度,靶蛋白浓度,2、标本处理原理（标记原理）,（1）、直标和间标（2）、细胞膜标和细胞内标（3）、两种染色：抗体和染料（4）、组合标记,间接免疫荧光标记法,直接免疫荧光标记法,抗原分布:Important for method optimization,表面，胞浆，核内是共同检测还是分别检测？,CD3,4,8, tetramer+Cytokines,CD
3、3,4,8, tetramer+DNA,Cytokines+DNA,CD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNA,Intracellular Cytokine-Protocol,2、提供的信息,（1）、方案：两种图形（散点图、直方图）（2）、百分率信息、强度信息（3）、分群：细胞大小（FS）细胞内颗粒（SS）（4）、设阈值、设门特征（细分）（5）、直接信息、间接信息,二、流式细胞仪的应用技巧一,整合项目，树立体系化概念，提高流式使用价值,白血病全过程评价,患者出现症状,各种抗原（参照白血病抗原选择原则）,诊断白血病，确诊疾病，对白血病进行分型以指导治疗,治疗,初诊时所用抗原中
4、能够代表白血病细胞的特殊抗原,评价疗效及治疗的疗程,同上,缓解期,动态跟踪患者缓解期的白血病细胞变化，及时控制在相应水平下,临床过程,FCM检测项目,意义,CIK细胞治疗过程的评价,治疗前病人免疫状况评价,T亚群、NK、CIK、细胞因子,是否适合做、能否能培养、值得做CIK,采集MNC,MNC数目、纯度、 T亚群、NK、CIK数目及比例,是否达到培养要求、调节细胞数,MNC数目、 T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况,培养,培养是否达标、回输时机,回输后,T亚群、NK、CIK、细胞因子,疗效评价、监测、下次治疗的时机,CIK治疗程序,FCM检测项目,意义,肿瘤细胞免疫特点,A
5、IDS全过程免疫细胞评价,基础免疫水平,T亚群、NK、CIK,当地不同年龄、性别、民族的免疫水平基础数据,高危人群HIV检测阳性,T亚群、NK、CIK、 CD4凋亡、细胞因子,HIV检测阳性前的免疫水平变化状况及CD4的凋亡,T亚群、NK、CIK 、CD3、CD4、CD8活化状况、细胞因子、CD4凋亡,HIV阳性AIDS,检出HIV到发病的情况,AIDS病人治疗,T亚群、NK、CIK、细胞因子、CD4凋亡、 CD3、CD4、CD8活化状况,疗效评价、监测、治疗效果及病情动态观察,AIDS过程,FCM检测项目,意义,骨髓移植或CD34细胞移植,动员,采 集,PBSC的冻存,解冻和回输,回输后免疫
6、功能的监测,并发症,三、流式细胞仪的应用技巧二,利用仪器的灵活性，充分整合项目,1、CIK细胞作用肿瘤细胞的凋亡分析2、不同细胞的转染、表达情况3、不同分型增殖的细胞分布4、sp细胞、非sp细胞,5、肿瘤细胞诊断时 （1）、胸腹水：把白细胞和癌细胞分开 （2）、穿刺，手术细胞：,6、组织中的浸润细胞：7、Th1/Th2细胞的分析,四、流式细胞仪的应用技巧三,利用仪器提供的参数，对所做实验全面分析评价,1、质粒转染中： 转染率 疫苗 转染的强度2、同时分析转染率和转染强度3、稀有细胞的额外发现： T亚期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK细胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD
7、16+56+4、Tunecl方法中 不同周期的凋亡状况 细胞阻滞状况 DNA断片发生时SOS状况,五、流式细胞仪的应用技巧四,了解相关知识及现有的评价方法，充分应用流式细胞,1. 白血病分型 形态学、免疫组化、PCR2. 细胞因子 生物活性测定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血单个核细胞产生细胞因子检测法FCM、 ELI-SPOT、FCM（STAT）3. HLA B27/B7 FCM、免疫法4. 凋亡、蛋白表达 FCM、免疫组化、PCR5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等,荧光显微镜下经丫啶橙/溴化乙啶染色,SGC-7901细胞24h,SGC-7901蒿甲醚组24
8、 h,SGC-7901 DDP组24h,ECV-304细胞 24h,ECV-304蒿甲醚组24h,ECV-304 DDP组24 h,六、流式细胞仪的应用技巧五,专项应用中的问题及解决方案,免疫细胞相对绝对计数造血干细胞和其他稀有细胞的检测血小板活化、膜糖蛋白及抗体检测DNA倍体分析，周期、异倍体分析细胞内因子（Th1/Th2）细胞因子（体液及培养液因子）各种凋亡检测（Apo.2.7 Tunecl、DNA亚二倍体）组织中免疫细胞和其他细胞（如CXCR、CCR）基因蛋白检测（如p53、Bcl-2等）白血病免疫分型B27检测动物检测过程中的问题,免疫细胞的检测,T细胞 分群标志 活化标志 亚群标志B
9、细胞NK细胞CIK细胞以T细胞亚群检测为例，其余的免疫细胞出现的问题类似,1、标准方案 抗 凝 血 组 织 胸腹水、灌洗液（单细胞悬液）,加入1ml 溶血素（NH4Cl或C液或A、B、C液）,上机检测,结果：CD3+ T Cell ：%、Abs CD4+ T Cell ：%、Abs CD8+ T Cell ：%、Abs,CD4/ CD8比值,2hr内加入 100ul Flow Count,（100ul/份） + 10ul 抗体标本标记 15-30 min,2、可能的问题及解决办法（1）、标本环节 抗凝血： A、抗凝效果不好：如果没有大的凝血块，该血可以使 用，但结果可能受影响。设阈值时最好采用
10、Fl1 （CD45所在）;如果有大的凝血块，不能用于检测。 B、标本在4或以下放置过：一般不做检测用。 C、标本放置时间大于48小时：检测时尽量用Fl1设阈值。 建议：最好使用新鲜标本检测，尤其是做绝对计数时。 D、动物血：对于猪、猴、兔、狗等大动物的，如人一样 处理。而如小白鼠等小动物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加样处理。如需做绝对计数，则要求计算 稀释倍数，比如10ul血加入490ul溶血素相当于稀释了 350倍。,2、可能的问题及解决办法组织标本： 组织标本做免疫细胞时，通常需要CD45设行，这样可排 除非血细胞。A、组织标本通常不需要研磨，只需用针头反复捣碎便可：这样可以减少组织
11、细胞的量。B、穿刺细胞：手术标本需要反复清洗表面附有的血液，否则会影响检测结果。C、组织标本一般保存在生理盐水中。,2、可能的问题及解决办法胸腹水、灌洗液： 通常也需要CD45设门A、都需要浓缩处理：一般取250ml左右，静置4hr后取沉淀物离心。B、如果需要计数，则需做体积换算，比如250ml500ul，相当于浓缩了500倍。组织、胸腹水标本，希望做2次过滤，第一次为标记前，采用200目过滤，第二次为上机检测前，采用300目过滤。,2、可能的问题及解决办法（2）、抗体环节试剂选择A、尽量选择试剂组合多的作为标记抗体，比如T亚群CD45/CD4/CD3/CD8：最佳选择CD4/CD8/CD3：
12、 可用，但做起来会有很多麻烦单一抗体： 不可用,2、可能的问题及解决办法B、选择试剂时，不但需要选择阳性标记，同时也需要选择阴性标记。比如：CD4T 细胞CD45+CD3+CD4+CD8- B 细胞CD19+CD3- NK 细胞CD3-CD16+56+ CD34+ 细胞CD34+CD38-尤其在科研项目中，一般应选择2-3个阳性标记，同时选择1-2个阴性标记，否则所做出来的结果将会有很大误差。,2、可能的问题及解决办法C、在医学中，一般标记抗原较弱的，需选择较强的染料，尤其我们在做稀有细胞的时候，比如DC细胞，CD34细胞，CIK细胞，间充质干细胞等，一般均选择标记PE细胞。标记条件：一般18
13、 25，如果温度低或高效果都不好标记时间：根据所用试剂量决定，一般不得低于15 min。,2、可能的问题及解决办法标记的先后顺序 A、先标记膜表面的，后标记胞浆内 B、先处理抗体，后加染料 C、透膜处理后的标本不能强烈振荡。,2、可能的问题及解决办法 溶血环节溶血素的选择 A、A B 液（主要是甲酸成分），一般需要专门的制备仪 C B、NH4Cl（主要成分是NH4Cl 、NH4HCO3、EDTA ） C、溶血素C（专配试剂）,2、可能的问题及解决办法 自配溶血素要求： A、必须在仪器试验后方可使用 B、有条件时需做pH、微粒分析 C、放置时间不宜过长，尤其是A液,2、可能的问题及解决办法溶血液
14、加入可能出现的问题 溶血效果不好 温度问题：C液溶血和温度关联较大，一般不能放 4冰 箱，可以采用水浴 37 溶血剂不够：可以离心后追加溶血剂,以上处理如果还不可以，则需要选择：不重要的标本：重新再标记重要而又没有剩余的标本：反复离心，选择1200-2000转左右的速度，建议每次离心均加入2-3mlNH4Cl溶血素。,有些抗体或染料对酸比较敏感：比如PE标记，溶血后会使其脱离，但这种现象是可逆的，静置10 -30 min,2、可能的问题及解决办法加入Flowcout环节 Flowcout必须在加入溶血素后才能加入，否则会影响检测结果，同时加入Flowcout后 2 hr 后必须上机检测。,2、
15、可能的问题及解决办法（5）、检测出结果环节：A、上机前需要摇匀标本，仪器开机超过30min，Flow check 10% 2% 外电压稳定等等。B、方案尽量采用完整方案，比如T亚群：由于Flowcout微球在所有通道上都有信号，一般选择没有使用的荧光通道作为收集通道，如果没有剩余通道，就选择荧光较强的染料所在的通道方案是实现正确操作和得到正确结果的平台，建议建立方 案时尽量建立完整方案,2、可能的问题及解决办法C、检测结果1）、检测结果必须严格按医学含义得到，比如,CD4+T细胞CD45+CD3+CD4+CD8-(百姓定义上的结果) (医学定义上的结果),2、可能的问题及解决办法2）、相对计数
16、：一般医院检测T亚群时可以只做相对数，这样就可以使用prism门，CD3+%、CD4+%、CD8+ %，如果需要浓度，则从血常规中得到 淋巴细胞的浓度 * 相应的 % = 浓度（即所谓的 双平台法），这时我们可以采用缩小设行的办法，得到准确的%。3）、绝对计数：AIDS往往采用单平台法得到浓度，这样我们可以采用扩大设行方法得到准确的绝对数。,2、可能的问题及解决办法3）、影响结果的因素： 电压、补偿不足或过头均影响 阈值设置不合理 设门范围 Flowcout,DNA检测,1、固定问题：70%酒精 106 细胞 700 ul 冰乙醇,2-3min,300 ul 蒸馏水,4-72 hr,2、离心：
17、1500转3、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2）,细胞因子的检测,1、解决干扰碎片（1）、-20静置，24hr（2）、4500转，离心,2、强度问题：外延浓度 0、5、10、20,Capture Beads,多种细胞因子FCM（STAT）的原理,Color-coded Microspheres,FL4,Main Menu,Differentiation of 10 Populations*,*Human Th1/Th2 Cytokine I Kit,FL2 (Reporter Parameter),FL4(Differentiator Parameter),
18、Main Menu,HLA-B27 检测中的问题,利用B27 荧光强度判定的阳性率很低。 原因： 通常B27的判定标准是荧光强度大于8 ，但这个标准是在加全量抗体的条件下做的，而目前大多数用户只加半量或1/4量做，导致荧光强度降低。 解决方法： 1 加全量抗体。 2 判定标准改为用阳性率大于90%。,ANNEXIN V/PI检测凋亡的问题,结果偏低 原因：1 没有用试剂配套的连接缓冲液。 2 消化贴壁细胞时用胰酶。 解决方法：1 消化细胞时不要用胰酶，要用EDTA，用配套的缓冲液。,结果偏高 原因：非特异性结合多 解决方法：换用新的试剂。,PNH检测的问题,粒细胞上CD55，CD59检测结果偏低，而在红细胞上正常。 原因：在进行抗体染色之前，没有进行溶血，导致了抗体先和红细胞结合，而无法与白细胞充分反应，产生了阴性结果。 解决方法：在染色之前，先进行溶血洗涤，然后再染色。,谢 谢!,云南省肿瘤医院昆明市人民西路174# 6501180871-8185656-2029、2056金从国 13888416834,
