1、,第15章 分子发光分析法Molecular Luminescence Analysis,第15章 分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）,分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态返回基态时发射光谱 M+能量M M+热量 M+ h +热量光子 光致发光 M+ h M 阴极射线 阴极射线发光 荧光 磷光 X 射线 X 射线发光 F P 热 白炽发光 寿命10-710-9s 10-310s超声波 声纳发光离子流 离子发光化学反应能化学发光 M+化学能M,第一次记录荧光现象 1575 西班牙内科医生、植物学家荧光是光发射概念、引入荧光术语 1852
2、 Stokes 观察奎宁、叶绿素提出用荧光作为分折手段 1864 Stokes第一个实际应用、铝一桑色素荧光测 1867 1965以来, 荧光光谱兴趣激增，生物化学家利用它的高灵敏度。二十世纪七十年代后期，引起国内学者注意,第15章 分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）,第15章 分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）,15-1 光致发光及影响荧光发射因素15-2 荧光分析法15-3 磷光分析法15-4 化学发光分析法15-5 光化学传感器,荧光 涉及吸收和发射两个过程 1、激发态 基态 激发态 分立轨道上
3、非成对电子 平行自旋更 n 稳定 n 净电子自旋 S=0 S=0 S=1 分子重态 M=2S+1=1 （跃迁几率很小） M=2S+1=3 单重基态 S0 激发单重态 S 激发三重态 T 电子从 S0 到 S 分子能量相应增加改变了分子对称性、 分子净的电子自旋（多重性）可能改变,第15章 分子发光分析法15-1 光致发光及影响荧光发射因素,2、去活化过程溶液中： 10-14-10-12 s 10-13-10-11 s 10-2-10-6 s 振动弛豫 内部转换 体系间的跨越 （发生在相同多重度间） （发生在不同多重度间） S2 S1 T1(S1) T2 10-15 s A1 A2 F P 磷光
4、发射 10-2-10 s 基态 S0 荧光发射 外部转换 10-7-10-9 s 发生在不同电子能态间 （熄灭）,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,2、去活化过程注意点 (1)气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能(2) 实现内部转换 a. S1，S2 电子能级差小 、易实现。 b. S1，S2 振动能级的位能面有交叉(3)体系间跨越的必要条件 电子自旋与磁场微扰耦合 a. S1、T1位能面在某处有容易达到的能量相交 激发态电子自旋反转， b. 微观磁场的微扰存在 分子多重态变化 产生 Br-,I-,CH3I重原子分子 带电粒子的极性分子或可极化分子易产生磁效
5、应 或离子外层电子云疏松 顺磁性分子 O2外层3d5五个电子不成对 内 (4) 外部转换使发光熄灭现象 重原子效应 T1 S0 比 S1 S0 可能性更大 外（溶剂）(5) 去活化众多过程中，以速度最快、激发寿命最短的途径占优势，相互竞争。,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型 (1) 从寿命 瞬时荧光 10-8s 内发射 分析中有意义! S1S0+ h S1+S0 (S1 S0) 2S0+ h 受激准分子 迟滞荧光 波长同瞬时荧光，寿命与磷光相似 刚性、粘稠介质中
6、E型 T1+ 活化能 S1S0+ h P 型 T1 + T1 S1 + S0 三重态三重态粒子湮没 S0+ h 寿命为相随磷光寿命的 1/2 复合(重组）A()+ h 1 A() + h 2 A.+( ) +e 重组+e A()+ h 3 A( ),、荧光的一些基本问题 a. 荧光类型 (2)激发光与荧光波长比较 Stokes荧光（溶液中） 荧激 可能 Antistokes荧光（高温稀薄气体中） 荧激 共振荧光（气体、晶体中） 荧=激(3)荧光波长 X光荧光 紫外、可见荧光 红外荧光,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 b.分子被激发时的散射问
7、题 激发光的能量太低、不足以外层电子跃迁到 S1 但仍可将电子激发至基态的高振动能级上 受激后能量无损失, 受激发后有能量改 瞬间(10-12) 返回原 变,返回原来稍高 能级 或稍低能级上 在不同方向上发射与原激 不同方向伴随的波长 发光相同波长1的辐射 发射为 1 瑞利散射 拉曼散射 特征： 散射强度 1/4 （拉)强度 (瑞)强度( IF/1000) 散射光波长激发光波长 拉曼带波长随激发光波长而变 拉- F = 为定值 反映了分子结构特性,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱 (1) 激发光谱 (2)荧光光谱 注
8、意：、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异,其真实光谱必须要对其光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正 、真实的激发光谱与吸收光谱非常近似，而不是相同,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱 (3) 溶液荧光光谱的特征 斯托克斯位移（ 荧激 ） 原因 溶剂化效应 h h 非辐射损失荧光光谱与激发光波长无关系 原因 荧光光谱与激发光谱成镜像对称关系 光谱形状决定于S1,S2的振动能级分布相似,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 c. 激发光谱和荧光光谱 (4) 三维荧光光谱
9、（总发光光谱、激发发射矩阵、等高线光谱） 给出三维信息,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 d.荧光物质的两个重要参数 (1)荧光分子的平均寿命 各种单分子的非辐射去 = 1 / ( kf +K ) 活化过速率常数之总和 荧光发射速率常数 内在寿命 0 （即K 时的 ） 0 = 1 / kf 荧光强度衰变 速率方程 It = I0 e - t / 或 It = I0 - t / ,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,、荧光的一些基本问题 d.荧光物质的两个重要参数 (2)荧光的量子产率 f 定义： 发射荧光的光子数吸
10、收辐射的光子数 f = kf / ( kf +K ) f (0.11)有使用价值 注意： a. 荧光的能量产率eq= 荧光发射时的能量吸收的能量 eq1 (红移) b. 荧光的量子效率 f = 处于发射荧光的激发电子态的分子的百分率 c. f, eq, f三个概念不同,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,4、荧光、磷光的测量 一般荧光分光光度计与紫外可见区吸光光度计异同 单束(光用于校正),第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,4、荧光、磷光的测量 荧光分光光度计,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,4、荧光、磷
11、光的测量a. 激光荧光光度计 1975 Harrington 研制 输出、反射 染料池 样品池 光栅,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,4、荧光、磷光的测量 b.电视荧光计 使用多色仪 Johnson设计 入射口狭缝样品池长轴 波长复盖 240nm 氙灯 无出射口狭缝 空间分辨 1 nm 入射口狭缝样品池长轴 时间分辨14.7 ms 无出射口狭缝 摄像管,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,4、荧光、磷光的测量,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,5、影响荧光发射因素 a. 强荧光物质的结构特点 （） 比 n
12、 有利 f （） 共轭 体系 f （） 刚性平面结构 f （） 取代基影响 给电子基团 f 吸电子基团 f(p ) 取代基位置:邻、对f 重原子取代基f ( p ),第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,5、影响荧光发射因素 b. 溶液环境因素 （）溶剂 取决于荧光体和溶剂的化学结构 ( 溶剂荧光物成化合物,荧光分子电离状态改变) f.max f 都有影响 重原子溶剂存在时 f(p ) 外重原子效应 （）温度 T f（）pH 平衡解离关系存在f.max f 均有影响,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,6、溶液荧光的猝灭 定义：荧光分子与其
13、它分子相互作用，改使荧光强度下降。 猝灭过程实质题与发光过程相互竞争、缩短发光分子激发态寿命的过程，具体形式机理各不相同。 自学讲义内容,第15章 分子发光分析法 15-1 光致发光及影响荧光发射因素,1、常规方法 a. 直接法 b. 间接法 与荧光试剂发生反应 定量关系 If = 2.3 f I0b c（ b c 0.05 时） If = k c （ I0、b 不变） 定量校正方法 外标法 增量法 2、荧光猝灭法 F-会使8-羟基喹啉铝配合物 荧光强度 , 测F-,第15章 分子发光分析法15-2荧光分析法,3、动力学荧光分析法 反应物或产物中的荧光物质浓度变化，测荧光随时间变化求含量方法？
14、 Fe () + H+ + A Fe () + B dB/dt = A Fe () H+ 当pH 一定 , A足够大, 反应初期, 积分 B = Fe () t 又 I fB = K B 则 I fB = Fe () t 或 I fB / t = Fe () Y = a x,第15章 分子发光分析法 15-2荧光分析法,、荧光滴定法 鲁米诺指示剂 H+时 UV下 兰荧光 OH-时 UV下 无荧光 、胶束增敏荧光分析 荧光试剂 配合反应 优点：a. 光学透明、稳定 b. 光化学上是非活性的 c. 价廉、使用方便 d. 对荧光测量有增溶、增敏、增稳的独特性质,第15章 分子发光分析法 15-2荧光
15、分析法,A、B混合物在测量条件下，荧光光谱相互重叠时，如何测量A、B 两物质？,信息处理及仪器技术 6、双波长法（三波长法） 7、导数荧光法 8、同步荧光光谱技术 （同时利用吸收和发射两个过程）*固定波长 例:丁省乙醇溶液 荧-激= 常数 = 如何决定！ Stoks 位移值,第15章 分子发光分析法 15-2荧光分析法,简化光谱、窄化谱峰,8、同步荧光光谱技术 *固定能量 (1/激-1/荧) 107 = = 常数 例: 芳环 1400 cm-1 振动带间隔*可变角 两者起始波长不同、扫描速率不同保持同一比例-线性测c 某一函数-非线性 干扰A 免避散光 提高重叠体系分辨率 激发波长 干扰B 发
16、射波长,第15章 分子发光分析法 15-2荧光分析法,9、时间分辨荧光技术 （利用 寿命信息） 排除干扰 应用 a. 荧光探针技术 b. 单分子测量技术,第15章 分子发光分析法 15-2荧光分析法,1. 磷光与荧光的不同点表现在 a. 峰值波长 PF b. p F c. p , I p 受重原子、顺磁性分子、离子存在增强、敏感 F , IF 反之 2. 磷光测量方法 a.与荧光测量类同 不同点： 固体样发射磷光、伴随发射荧光 b. 如何解决 磷光同光源散射 磷光同 荧光 分离开来 如旋转简磷光计,第15章 分子发光分析法 15-3磷光分析法,2. 磷光测量方法,第15章 分子发光分析法 15
17、-2磷光分析法,3.常规（低温）磷光法 a. 为什么要低温测量？ 减少非辐射跃迁对磷光发射影响 b. 如何实现低温测量？ 液氮77K EPA 明净玻璃态 c. 定量关系式 （醚 5：异戌烷 5：乙醇 2） Ip = 2.3 pI0b c = Kpc 磷光的量子产率p： KST . . KP . KST +KF +Ki KP + Kj 与S1态有关的非辐射跃速率（除KST外） 与T1态有关的非辐射跃迁速率 d. 重原子效应的利用 灵敏度 选择性 ,第15章 分子发光分析法 15-2磷光分析法,4. 室温磷光法 a.为什么要引入室温磷光法? 常温法缺点：低温装置复杂 溶剂选择 操作难 b.室温法要
18、解决主要矛盾？ 克服室温下 TS0 的非辐射跃迁 使IP 途径 固体表面室温磷光 胶束稳定的溶液室温磷光 1972年 1980年 固体载体,第15章 分子发光分析法 15-2磷光分析法,5.敏化溶液室温磷光法 一种间接的磷光分析法 SD1 TD1 TA1 激发 IP SD0 S A0 能量供给体D 能量受体A 被测物 cx 无磷光或弱磷光 发磷光 IP IP =Kcx关键：选择能量受体A * D 在激发时 A 的 A 要小 * TD1 TA1 * A 在所测溶剂中 pA 要大 A：1，4二溴荼6. 磷光分析应用 多环芳烃 农药 生物碱 毒品 药物 生物分子,第15章 分子发光分析法 15-2磷
19、光分析法,1. 原理 R P* P+ h 或 R P*+A A* A+ h 注意: h 是荧光 磷光 2. 实现化学发光条件 a. 提供足够的反应焓的能量，基态S0 S1 氧化反应 裂解反应 170-300 KJ/mol b. 要有化学反应历程，反应能至少使一种物质分子吸收至S1 气相化学发光反应 液相化学发光反应 c. S1 能发射h,第十五章 分子发光分析法15-4化学发光分析,3、化学发光效率 发光分子数化学发光总量子产率CL = - = CE EM 参加反应分子数 化学激发效率 激发态分子发光效率4、定量关系 ICL（t）d t = CL c y = a x 5、应用 环境监测,第十五
20、章 分子发光分析法 15-4化学发光分析,光化学传感器技术光谱化学和光学波导与测量技术,第十五章 分子发光分析法15-5光化学传感器,光学波导 数值孔径 波导的损耗与色散,第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,2.测量技术 消失波 dp有效深度 (1/e),第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,3.分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）,第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）,第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）,第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,分子识别元件（感受器）和信号转换器（换能器）,第十五章 分子发光分析法 15-5光化学传感器,分子发光分析法结束请预习第十六章,
