1、食品有害微生物检测与控制(10),食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群的食品卫生学意义,作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,食品中大肠杆菌的检验,1982年美国 食物中毒；,我国：1997年在一定范围内开展监测，已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到该菌，并在1999年我国苏皖毗邻地区突然暴发了肠出血性大肠杆菌O157:H7，,GB4789.3-201
2、0 大肠菌群测定,定义：Coliforms，一群在36培养48h可发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断食品中肠道致 病菌污染的可能。,食品中大肠杆菌的检验,大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染 。,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷
3、白氏菌和阴沟肠杆菌等。,总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐
4、成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,概述,生物学特性 1) 形态与染色 2) 培养特性 3) 生化特性 4）抵抗力 5）致病性 1) 形态与染色 G、有鞭毛、无芽孢或有荚膜，两端钝圆短杆菌。大小为(1.11.5) m X (2.0 6.0) m (活菌)或(0.40.7) m X(1.03.0) m (染色菌)，绝大多数菌株有周身鞭毛，能运动，周身还有菌毛，无芽孢，某些菌株具有荚膜。,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,概述,2) 培养特性 在普通培养基上：长成23mm的S型小菌落； 在鲜血
5、琼脂平板上:生长，有些菌株可见型溶血环*； 在麦康凯培养基上:因发酵乳糖而产生有色菌落 在SS培养基上:大肠杆菌一般不能生长，少数生长的菌落也因发酵乳糖而呈红色； 在伊红美蓝琼脂平板上:生长成紫黑色带有金属光泽的菌落； 在液体培养基中:呈均匀混浊生长，形成荚膜，管底有粘性沉淀培养物呈特殊的臭味。,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,概述,3) 生化特性 大肠埃希氏菌发酵多种糖 ：葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速发酵乳糖，各菌株对蔗糖、水杨苷、卫矛醇及棉子糖的发酵力不一致，吲哚 ， MR ，VP ，枸橼酸胺盐 (I M V C + +
6、 - -)，尿素酶 ，硫化氢 ，氰化钾培养基不中生长，丙二酸盐利用，可使谷氨酸和赖氨酸脱羧基，苯丙氨酸，氧化酶，接触媒。,食品中大肠杆菌的检验,3 致病性 (1)致病因素：侵袭力 内毒素 肠毒素 侵袭力 大肠杆菌具有K抗原和菌毛： K抗原：有抗吞噬作用，有抵抗抗体和补体的作用 菌毛：能帮助细菌粘附于粘膜表面。有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表皮层引起炎症。 内毒素 大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性： 其脂类A是毒性部位 特异多糖有助于细菌抵抗宿主的防御机制。,Company Logo,概述,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,概述,肠毒素 大肠埃希氏菌肠毒素有两种： a.不耐热肠毒素(LT
7、)：蛋白质，加热65经30min即被破坏， 促进肠粘膜细胞大量分泌肠液,引起腹泻； 生食 b.耐热肠毒素(ST)，ST无免疫性，耐热，100经10-20min不被破坏，它也可引起腹泻。,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,概述,(2)所致疾病 肠外感染 肠外感染 泌尿系统感染 败血症 胆囊炎 肺炎 新生儿或婴儿脑膜炎等。,Company Logo,概述,腹泻 4 种大肠杆菌都可引起腹泻： 产毒素大肠杆菌-是婴幼儿及旅游者腹泻的主要原因； 致病性大肠杆菌-是婴儿腹泻的主要原因，严重者可致死； 侵袭性大肠杆菌-主要引起较大儿童和成年人腹泻，有时甚至可引起爆发流行； 出血性大肠埃希氏菌
8、O157-引起的主要临床症状是腹泻(重者水样腹泻)、腹痛、呕吐，是老幼患者死亡的主要原因。,食品中大肠杆菌的检验,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,第一法：MPN法第二法： VRBA-MUG平板计数法第三法：Petrifilm测试片法,大肠菌群计数检验流程,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不产气（-）小导管里无气泡,LST产气（+）,食品中大肠杆菌的检验,MPN法,第二法 VRBA平板计数法,选择15150平板计数典型和可疑菌落,361 18h 24h,挑选10个菌落接种到BGLB,典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，0.5mm,食品中大肠杆菌的检验,MPN法,
9、食品中大肠杆菌的检验,MPN法,大肠杆菌计数MPN法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍稀释,选择3个连续稀释度样品匀液接种LST,482h,361,不产气,产气,EC肉汤,450.2,242h,不产气,产气,EMB琼脂平板,361,242h,营养琼脂斜面培养,生化试验，革兰染色,查MPN表，报告,如何报告结果？,根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法,食品中大肠杆菌的检验,MPN法,食品中大肠杆菌的检验,美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Cha
10、pter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria 原理：由于96%的大肠杆菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠杆菌阳性。 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷（MUG）对大肠杆菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。,Company Logo,VRBA-MUG平板计数法,第二法 VRBA-MUG平板计数法,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,VRBA-MUG平板计数法,VRBA-MUG平
11、板计数法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液，接种VRBA-MUG平板,紫外光下，计数发荧光的菌落,报告结果,361,1824h,食品中大肠杆菌的检验,由希华,徐标,李恒庆,宗雪梅.荧光法快速测定水中粪大肠菌群J/OL.中国环境监测,2019(02):1-52019-05-10.https:/doi.org/10.19316/j.issn.1002-6002.2019.02.13.,Company Logo,VRBA-MUG平板计数法,选择不同的地表水废水样品进行荧光法与多管发酵法比对测试，讨论方法适用性。,荧光法与多管发酵法结果之间
12、有显著的线性相,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,PetrifilmTM测试片法,第三法 PetrifilmTM测试片法,PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB培养基，冷水可溶性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂，可增强菌落计数效果。E .coli能产生-葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数蓝点带气泡的菌落即为大肠杆菌数，红点带气泡和蓝点带气泡的菌落之和为大肠菌群数。,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,PetrifilmTM测试片
13、法,大肠杆菌PetrifilmTM测试片检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液，接种PetrifilmTM大肠杆菌测试纸片,计数蓝色带气泡菌落,报告结果,361,242h或482h,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,PetrifilmTM测试片法,史梦雨.消毒餐饮具中大肠菌群的两种方法比较J.中国城乡企业卫生,2018,33(12):76-77.,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,PetrifilmTM测试片法,食品中大肠杆菌的检验,Company Logo,大肠菌群控制,大肠菌群控制（冷冻饮品生产为例子）,
14、人,机,料,法,环,食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群控制,“人”,完善企业更衣消毒设施，独立设置更衣间与消毒间，更衣间安装紫外灭菌灯、工作衣架。,消毒间安装洗手池、酒精喷淋器、干手器。,车间进入门口放鞋靴消毒池。,严格规定进入生产车间的人员必须清洗和消毒手，必须穿经消毒的工作衣，更换工作鞋并在消毒池中消毒后方可进入车间。,食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群控制,“机”,严格落实生产设施、设备清洗消毒制度，定期对生产设备及管道用CIP 清洗消毒或用90 以上的热水消毒，预防大肠菌群的滋生和繁殖。一旦产品中检出大肠菌群，要对生产设备和管道进行彻底消毒。,食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群控制,“料”,严格验
15、收原辅料，重点查验大肠菌群项目，尽可能购买不含大肠菌群原辅料。对原料产品标准中没有检验大肠菌群的进行自检，做到心中有数。定期自检生产用水，必要时进行杀菌处理。包装袋使用前进行紫外杀菌处理。,食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群控制,“法”,灭菌一定要彻底，一般温度在90 以上，灭菌15 min 以上，就能使产品达到无菌状态。注模消毒后一定要用无菌水进行冲洗，避免注模二次污染。要避免交叉污染，严格区分开生区和熟区。,食品中大肠杆菌的检验,大肠菌群控制,“环”,在生产车间安装足够的紫外灭菌灯，对生产环境定时杀菌。生产车间定时通风除湿，防止大肠菌群的滋生和繁殖。,*1993年，Jack In The Bo
16、x快餐连锁店出售未煮熟的污染汉堡引起700多人（以儿童为主）食物中毒，并造成4人死亡。这一事件使大肠杆菌O157:H7臭名远扬。* 2001年夏天，在大肠杆菌O157:H7爆发殃及35人之后，ConAgra Foods立刻召回了怀疑受到污染的1900万磅碎牛肉。美国疾病预防和控制中心估计，美国每年因大肠杆菌O157:H7致病总人数大约为73 000人，尽管上报的病例已有所下降。 *1998年，佐治亚州亚特兰大水上公园发生的大肠杆菌O157:H7大爆发使得多名儿童住院。 *1996年5-8月，日本中学和幼儿园相继发生多起大肠杆菌O157 集体 中毒事件，波及44个地区，7万例，死亡12人.与芽菜
17、有关。,Company Logo,益生菌：不致病，能合成维生素B和维生素K，生产大肠菌素，对机体有利； 条件致病菌：在机体因内外因素所致抵抗力下降或菌体侵入肠外组织或器官时条件下致病； 致病菌：引起肠道感染的有四类： 产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC） 出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC) 肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli，EIEC) 肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC） 带菌的牛和猪是传播本菌引起食物中毒最重要原因，人的带菌亦
18、可污染食品，引起中毒。,Company Logo,EMB琼脂,主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美监。原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。不发酵乳糖产酸的细菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心,Company Logo,靛基质试验：甲基红试验：V-P试验：柠檬酸盐试验：,Company Logo,4、甲基
19、红（MR）试验和V-P试验,二、常见生理生化试验,糖（醇）类代谢试验,1、MR试验原理： 一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应2、V-P试验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（试验结果同MR试验）,二、常见生理生化试验,糖（醇）类代谢试验,V-P试验 方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于35培养48h后加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）和乙
20、液（40%KOH溶液），振摇。,结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于354h后仍如故者即为阴性。,二、常见生理生化试验,蛋白质和氨基酸的代谢试验,1、明胶液化试验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。,阳性,阴性,2、靛基质试验（吲哚试验） 一些细菌可以分解蛋白胨的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。,阳性,对照,1、枸橼酸盐利用试验,二、常见生理生化试验,有机酸盐和铵盐的利用试验,一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。,培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性,
