1、疫苗基础知识与疫苗研制,宁波荣安生物药业有限公司乐威,生物制品概念,是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。,人用生物制品,细菌类疫苗（包括类毒素）病毒类疫苗抗毒素及抗血清血液制品细胞因子生长因子酶体内及体外诊断用品其它生物活性制剂，如变态反应原、抗原抗体复合物、免疫调节剂、微生态制剂等。,疫苗基础知识,疫苗（Vaccine）一词与天花疫苗（牛痘苗）有关，拉丁文 “vacc”是“牛”的意思。,疫苗基础知识,与疫苗有关的三位伟大的科学家：琴纳、巴斯德、科赫。,琴纳的贡献,发明了牛痘疫苗预防天花,18世纪50的儿童活不到10岁
2、，其中40死于天花。每一块大陆都曾有数百万人死于天花。,1979年10月26日世界卫生组织宣布：天花已从地球上被彻底消灭。,巴斯德的贡献,发明了减毒疫苗发明了狂犬疫苗,巴斯德让当时被疯狗咬伤的人的发病率由20下降到1。,科赫的贡献,发现炭疽杆菌确定传染病是由微生物引起的,疫苗的作用,预防疾病流行,如果没有疫苗，这世界将会怎样,人口：可能不到10亿；平均寿命：可能只有4045岁；社会发展和科学进步速率至少降低一半；每年都会有各种各样的疾病流行带走数百万甚至上千万人的生命，就好像每年都在进行世界大战，人人生活在死亡的恐惧之中；,治疗性疫苗，如肿瘤疫苗、结核疫苗。,疫苗基础知识,疫苗不全是预防性的,
3、疫苗分类,灭活疫苗（细菌、病毒、立克次体及类毒素）减毒活疫苗（卡介苗、麻疹减毒活疫苗）组分疫苗（流感亚单位疫苗）基因工程疫苗（乙型肝炎疫苗）血清（白喉毒素、破伤风毒素）,灭活疫苗,减毒活疫苗,方法：将病原微生物（细菌或病毒）在人工培育的条件下，促使产生定向变异，使其极大程度地丧失致病性，但仍保留一定的剩余毒力、免疫原性及繁殖能力。细菌性如：卡介苗（BCG）、炭疽、鼠疫等。病毒性如：麻疹（Mv）、脊髓灰质炎（OPV）、流行性腮腺炎、风疹、甲型肝炎、黄热病等。,灭活疫苗和活疫苗比较,疫苗使用基本原则,正确选择使用疫苗；高素质的免疫接种人员；严格掌握免疫程序；认真选择接种对象；正确掌握禁忌症；保证冷
4、链要求；认真检查使用疫苗。,疫苗接种方法,皮上划痕法；（炭疽、鼠疫）皮内接种法；（卡介苗）皮下接种法；肌肉注射法；静脉注射法；（抗蛇毒血清、肉毒抗毒素）口服法；（OPV糖丸）无针注射法；喷鼻法和气雾喷入法。,疫苗免疫程序的内容,免疫初始年龄；必须接种的次数；针次之间恰当的间隔时间；是否需要加强免疫；联合免疫的问题。,疫苗常见不良反应,一般反应：包括局部反应和全身反应。 局部反应：红晕、肿胀、疼痛。 全身反应：发热、头晕、乏力。异常反应：包括非特异性反应、精神性反应和变态反应 非特异性：化脓。 精神性：晕厥、急性休克。 变态反应：皮疹、过敏性紫癜、血管神经性水肿。,中国微生物毒力分级,一类：传染
5、性强，实验室感染机会多，感染后易发病，发病后症状重，危及生命，缺乏有效防治措施。如鼠疫杆菌、霍乱弧菌、天花病毒、埃波拉病毒。二类：实验室感染机会多，症状重，危及生命，不易治疗。如炭疽芽孢菌、肉毒梭菌、狂犬病毒、出血热病毒、登革热病毒、甲型和乙型肝炎病毒。,中国微生物毒力分级,三类：仅具一般危害，能控制感染，可有效预防。如肺炎链球菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、狂犬病固定毒。四类：低致病性或经人工减毒。如鼠疫、霍乱、麻疹病毒、流行性乙型脑炎、病毒性肝炎。,狂犬病毒街毒和固定毒,街毒：自然条件下可使人或动物致死。固定毒：街毒在试验动物中传代，使其致病性减弱，仍保持免疫
6、原性。狂犬病毒街毒为二类病原微生物，固定毒为三类病原微生物。生产用狂犬病毒毒株为狂犬病毒固定毒。,疫苗研制的一般程序,分离病原体并进行鉴定；研究机体免疫反应，确定免疫原；致病微生物体外培养研究；根据需要，研制灭活疫苗或减毒活疫苗，也可以提取有效抗原成分，制成亚单位疫苗；制订质量标准，包括检定方法研究。,人用狂犬病疫苗工艺流程,细胞复苏,细胞传代,接种病毒,多次收获病毒液,超滤浓缩,灭活,柱层析,离心,病毒收获液检定,病毒灭活检验,配制,分装,包装,纯化液检定,半成品检定,成品检定,中国狂犬病疫苗发展简史,1980年以前：羊脑疫苗1980年1995年：原代地鼠肾细胞疫苗（铝佐剂）1995年200
7、0年：浓缩原代地鼠肾细胞疫苗（铝佐剂）2000年2005年：原代地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞纯化疫苗（铝佐剂）2005年至今：原代地鼠肾细胞纯化疫苗和Vero细胞纯化疫苗（无佐剂）,中国狂犬病疫苗发展,安全性,有效性,组织疫苗,细胞疫苗,纯化疫苗,1.3IU/剂,2.5IU/剂,4.0IU/剂,无防腐剂疫苗,冻干疫苗,现代生物技术在狂犬病疫苗生产中的应用,生物反应器细胞培养技术膜过滤技术膜超滤技术层析技术冷冻干燥技术,地鼠肾细胞疫苗和Vero细胞疫苗,原代细胞和传代细胞,原代细胞培养指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和
8、功能 。传代细胞系指来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞系 。,细胞库,通过培养细胞用以生产连续多批制品的细胞系统，这些细胞经充分鉴定并证明无外源因子。细胞库包括原始细胞库、主细胞库和工作细胞库三级。工作细胞库：由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，冻存于130或以下用于生产。,毒种种子批,包括原始种子批、主种子批和工作种子批的已验明其来源、历史和生物学特性并经临床研究证明其安全性和免疫原性的病毒株悬液，该悬液应为单一批，以确保其组成均一，并经充分鉴定。工作种子批：按国务院药品监督管理部门批准的方法，从主种子批传代而得到的活病毒均一悬液，等量分装贮存
9、用于生产疫苗。,三级库管理的必要性,避免混淆保证种子细胞和毒种的稳定性保证生产均一性，减小批间差,Vero细胞培养方式,静止培养（克氏瓶）转瓶培养悬浮培养（载体）,Vero细胞转瓶传代,消化液：胰蛋白酶和（或）EDTA传代比例：1：31：6消化时间：细胞状况、消化液浓度、消化液pH值、消化温度培养液：含810新生牛血清的MEM，pH7.2培养液量：1500ml/15L瓶培养温度：37,狂犬病毒,子弹状长180nm、直径75nm最大特点之一就是嗜神经组织性 G蛋白是其主要表面抗原,病毒接种及收获,维持液：含0.1人血白蛋白的MEM，pH7.6培养温度：3335病毒收获液检测指标：无菌检查、支原体
10、检查、病毒滴度,定温室转瓶培养,中间品冷库,澄清及超滤浓缩,澄清采用不同孔径的微孔滤膜澄清的目的是降低生物负荷，去除细胞碎片等影响超滤过程的杂质，部分去除Vero细胞蛋白及DNA。超滤采用100K500K滤膜超滤的目的是浓缩狂犬病毒，降低收获液体积，去除小分子无效蛋白，减轻后期处理体积及蛋白压力。,超滤原理,超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,超滤原理,凝胶过滤层析原理,凝胶过滤层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。不同规格的凝胶其网孔直径范围不同，只允许分子量在一定范围的蛋白质分子进入，大的蛋白质分子被排阻在外，故形象地称为分子筛。,凝胶过滤层析原理,柱层析纯化,谢 谢 ！,
