1、灭 菌工艺及灭菌设备验证,黑龙江省所姜连阁 2013年1月,一般指没有活体微生物存在的药品。在药品制剂类别中，无菌药品也可称为无菌制剂无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料-药品生产质量管理规范（2010年修订）附录1.无菌药品,无菌药品,基 本 概 念,？,106 100（1） 10-6（10-3）,无菌保证水平（Sterility Assurance Level）-SAL,基 本 概 念,采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一采用无菌生产的SAL不得大于10-3无菌生产工艺仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌的产品,适用于
2、粉针剂或部分小容量注射剂,SAL定义-产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。评价灭菌（无菌）工艺的效果，该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。,无菌制剂主要有：注射剂植入剂、冲洗剂、眼内注射溶液、眼内插入剂供手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂，用于手术、创伤、烧伤或溃痒等的软膏剂、乳膏剂、气雾剂、喷雾剂局部用散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂,基 本 概 念,注射剂药途径特 点,基 本 概 念,直接进入组织或血液吸收快作用迅速可靠,注射液注射用无菌粉末注射用浓溶液,肌肉注射静脉注射,注射剂与其他剂型相比 无菌制剂,质量要求高生产过程控制严格,注射剂-将药物制成无菌溶液、混悬液或临用前制成液体的
3、无菌粉末供注入人体的制剂. 是临床上使用广泛的制剂。,无菌无热原无不溶性微粒高纯度,无菌药品特点,？,基 本 概 念,微生物微粒药物降解（氧化、水解）,基 本 概 念,过滤、消毒、灭菌,工艺控制（PH、温度、时间、空气）,注射剂生产的基本要求,合理的厂房、设备、措施设计合格的人员合理的生产方法、步骤和控制方法工艺验证和方法灭菌工艺验证,生产场所设施设备重要的支持系统原材料包装材料产品设计分析化验规程仪器校准操作人员验证过的工艺,硬 件软 件人 员,微生物基础知识,真核微生物,原核微生物,病毒,有细胞结构,微生物,无细胞结构,微生物-,是指一类体积微小、结构简单，大多是单细 胞的，必须用光学显微
4、镜观察形态的微小生物的通称。,肉眼看不见、看不清楚的微小生物,微生物基础知识,个体小，作用大。分布广，种类多。生长繁殖快，代谢强。易变异。,微生物基础知识,微生物生物学特征,植物叶子表面附生微生物- 皮肤上含细菌-洗过后几小时之内-人的肠道内微生物-粪便中细菌-一般人每个喷嚏的飞沫-感冒患者一个喷嚏-,微生物基础知识简介,约100万个/克。约10万个/cm2恢复到原来的数量约100万亿大约占粪便干重的1/3含4500-150000个含8500万个（有传染性）,微生物无处不在,常见微生物,微生物基础知识简介,微 生 物 分 布 特 点,G+,G-,细菌芽胞的形成及其特性,摘自 http:/www
5、.microbe.org/microbes/spores.asp,内生孢子产生于 Gram+ 细菌: 芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属Clostridium,仅含核酸及少量萌发必需物，皮层含DPA和Ca2+复合物，能抵御各种恶劣环境，可休眠上百万年。真菌孢子因不具上述特性，而不耐热。（DPA：吡啶二羧酸）,常用的灭菌方法二种：物理灭菌法和化学灭菌法物理灭菌技术是利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物理灭菌技术。该技术包括干热灭菌、湿热灭菌、除菌过滤法和辐射灭菌等。化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方
6、法，可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂，如环氧乙烷属于气体灭菌剂的一类。一旦温度超过上限，微生物细胞中主要的蛋白质、酶及核酸便会被永久性破坏，细胞膜被融解，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。热力学灭菌是使用最普遍并且研究最为彻底的灭菌方式。,灭 菌 基 本 原 理,灭 菌 基 本 原 理,微生物的耐热性可按下列顺序排列(耐热性从高到低):绝大多数细菌45不能生长，80100可被迅速杀灭。需氧菌中的芽胞杆菌属 厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属,具有较强的耐热性,物理/化学条件 在较高温度下生长有二价阳离子温度和相对湿度在90 125之间，相对湿度在20% 50%时，细菌芽胞表现出最大的耐热性当相对湿度超出这一范
7、围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。湿度对芽胞破坏性过程起促进作用，所以湿热灭菌较干热灭菌较低温度。,影响热力灭菌的因素,湿热灭菌法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌。（一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没）。湿热灭菌法系导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。具有穿透力强，传导快，灭菌能力甚强。【水由液态变成气态时，会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量(即汽化热)】。因此应尽可能使用饱和蒸汽进行灭菌。湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。用于药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损
8、坏的物质，均可选用。常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器和过热湿热灭菌水灭菌器等。,湿 热 灭 菌,干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。灭菌介质通常为被灭菌品所处湿度下的热空气干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的这一特点如170-250，甚至更高，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热是去热原最为有效的方法之一。干热去热原工艺进行验证，应证明该工艺能使标准内毒素至少下降3个对数单位。 在制药工业中，干热灭菌被广泛用于不耐受高压蒸气的热稳定性物品的灭菌。如玻璃、金属
9、设备、器具，不需湿气穿透的油脂类（甘油、油类、凡士林、石蜡），耐高温的粉末化学药品（滑石粉、磺胺类药物）等，但不适用于橡胶、塑料及大部分药品。革兰阴性细菌细胞壁中的脂多糖-内毒素。低剂量内毒素会导致人体发热反应，故而也称之为热原。,干 热 灭 菌,使用范围可分为试验室器具用，生产制剂用，生产器具用干热灭菌设备。按使用方式分为连续式和批量式，批量式干热灭菌设备如干热烘箱，可用于内毒素检验用玻璃、金属器具的灭菌和除热原，以及生产设备部件、生产器具的灭菌除热原；连续干热灭菌设备，如隧道烘箱，可用于小容量注射剂的生产。按加热方式可分为：以辐射加热为主的热辐射式干热灭菌机和以对流加热为主的热层流加热式干
10、热灭菌机等。,干 热 灭 菌,在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。,微生物的热致死特性,半对数座标,Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标,无菌的影响因素可用下式表示: PNSU=N0-DR PNSU指非无菌品概率N0指灭菌前产品的污染水平DR指灭菌时的杀灭水平。 最终产品的无菌质量取决于两个因素灭菌前的含菌量控制灭菌工艺的杀灭效果。,微生物的热致死特性：受热死亡速度符合一级动力学方程dN/dtK(N0Nt) N0为t0时，存活的微生物数； Nt为t时被杀灭的微生物数； N为t时存活的微生物数 K为常数。将上式积分得到：lgNt lgN0(K2.303)
11、t,专 业 名 词,它是分析灭菌工艺效果的重要生物学参数。并且其数值可通过残存曲线法或阴性分数法加以确定。lgN0lgNtlg（N0Nt）t(K2.303)lgl01,所以D= t=2.303K.即：D是直线斜率的负倒数D 值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。,对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下，D 值随灭菌温度的变化而变化。灭菌温度升高时，直线方程的斜率变大，即使微生物杀灭90所需的时间就短灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长,在湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的z值在8-12之间湿热灭菌计算时z通常取10；干热灭菌计算时Z通常取20，去热原时Z通常取5
12、4 。 Z=直线斜率的负倒数, 其中:D1指温度为T1时的D值， D2指温度为T2时的D值。,Z=-T/D =(Tl-T2)/log10 (D2/D1)，,F0D l21LgNFTDTLgN达到同样灭菌效果时，LgN 等值,指在某一温度T()下灭菌1min 所获得的标准灭菌时间,所以 F0FTD121DT,L= D121/Di =10 (Ti-121)/ZTi指各个灭菌时段的温度标准参照温度（121）Z10。,100灭菌时1分钟，相当于121 灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟。105灭菌40分钟时，Fo约为 1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位116下灭菌lmin 对
13、芽孢杀灭效果只有标准灭菌状态下的32121下灭菌lmin 相当于116下灭菌3.16min,可用灭菌率计算FT值=F0L=8/0.316=25.3F0=10 (Ti-T121)/Z dt=10 (116-121)/10 *25.3=8根据梯形规则，将整个灭菌过程(包括升温、保温和冷却阶段)的灭菌率累加，从而估算出某灭菌程序在标准温度下的等效灭菌时间：F0=t（L1/2+L2+L3+Ln-1+Ln/2）, t指测量温度的时间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始及结束时间段的灭菌率非常小,可将公式简化为:FT=tL。,由 FT(LgN0LgNT)DT， FTDT LgN0LgNT，则lg
14、NTlgN0FTDT。根据灭菌设备内温度监控系统所测得的物理参数，估测某灭菌程序对微生物的杀灭效果。DT表示某实际微生物（待灭菌物品中的污染菌)或假设的微生物(生物指示剂)在T下的D值。例如，假设F0为8分钟，DT=0.5分钟，数量为106，由公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量为10-10，SAL=lgNT =6-8/0.5=-10。在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值: SLR=LgN0-LgNT= FTDT =6-(-10) =8/0.5=16。,生物指示剂，简称为BI，是对特定灭菌者 工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭 菌效力的微生物制剂，生物指示剂多为芽胞类细菌，具有更强的耐
15、受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。采用生物指示剂做对照试验，是评判一个灭菌程序有效性的直接方法而且也是最佳方法。,常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式芽胞条芽胞悬浮液自含型生物指示剂,芽胞条 将芽胞接种于滤纸片、玻璃、塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性。直接接种到产品中.适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺.,芽胞悬浮液 芽胞悬浮液可被接种待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果。芽胞接种到液体产品时，其耐热性会增强或降低。如果不宜被直
16、接接种于产品或耐热芽胞与产品不相适应，则可用模拟产品（生理盐水或其他溶液）替代。但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性质(如粘度和pH)，并且耐热芽胞在替代品中的D值（耐热性）不得小于在产品中的D值。否则将影响到灭菌工艺验证或日常监控的可靠性。,自含型生物指示剂 是将芽胞条(或片)加入到含有指示剂的培养基包装内(如小瓶内)，培养基单独包装并与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养基小瓶使芽胞条(或片浸没在培养基内，在适当温度和时间内培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜色变化判断其生长状况;或将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内。自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很
17、大的相关性；生物指示剂的包装要易于杀菌剂透过。测定D值时务必要考虑包装可能会引起杀菌效来的滞后，不能仅测定芽胞条(或片)的D值。,灭菌溶液时，多选用自含型安瓶瓶生物指示剂灭菌织物时，多选用芽胞条灭菌管路时，选用特殊生物指剂(如用接有芽胞的钢丝、线等)以测试死角处(最冷点)的灭菌状况,注射剂,无菌生产过滤除菌无菌分装,热压灭菌,注射剂灭菌工艺 的选择,EMEA 灭菌工艺决策树,风险增加,一般是湿热灭菌方式 F08 ，首选过度杀灭法F012 ，如不能耐受过度杀灭，选用残存概率法8F012 。,基 本 概 念,无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系,SALF0/D lgN0 假定D121为1,确立灭菌
18、终点-使微生物的残存概率下降到100，在此基础上再下降6个对数单位(即微生物的残存概率不超过1/百万，或PNSU10-6)灭菌过程中所产生的各项物理和生物学参数应能保证其灭菌效果达到PNSU=10-6。,灭菌工艺开发,FT =（lgN0-lgNT）DT如果N0和DT已知，为使灭菌终点达到10-6的要求，可计算出灭菌前的带菌量。 例如，灭菌前每个容器内含有l00个耐热芽胞， 其DT = 1分钟，灭菌值F0要达到8分钟， 才能使产品中微生物降至100后，再下降6个对数单位: F0=2-(-6)x1=8分钟。F0=8分钟是灭菌工艺必须达到的最小目标值。也可根据灭菌设备的性能和产品的热稳定性确定F0的
19、上限。,灭菌工艺开发,过热灭菌时，不用考虑灭菌前含菌量。这并不意味着就不用对灭菌前含菌量进行控制。相反，控制灭菌前产品中的污染菌含量也是非常重要的。过热灭菌工艺常用于热稳定性物品的灭菌，如包装材料和生产设备等。验证时，先通过确定完全杀灭含有106个嗜热脂肪芽胞杆菌的生物指示剂（D121值为1.5分钟左右)所需的灭菌时间，再将这个时间加倍即为实际生产时的过热灭菌时间。,过热灭菌,建立在含菌量控制基础上的灭菌工艺，其灭菌终点是由灭菌前半成品的含菌量及所含微生物的耐热性来决定的。生产时应避免产品被耐热性微生物污染，而不能依赖于最终灭菌。有些产品在灭菌前进行无菌生产和灌装。控制灭菌前产品中的含菌量，可
20、以降低灭菌条件，降低灭菌时对产品及其容器/密封件的潜在破坏性。对热敏性产品(如蛋白质)非常重要,残存概率法,如果在灭菌前产品中没有耐热菌，可假设有一定数量的芽胞存在于其中(常规生产时可能会碰到的最差状况)。如设每只容器内含有 D121=0. 5分钟的耐热芽胞100个。根据与假设菌的数量及耐热性相当的实际生物指示剂(BI)来确定一个灭菌工艺的灭菌效果。根据置于灭菌产品内的测温探头的测量数据计算出理论F0值，并对多次运行的F0值进行平均，将平均F0值与从接有生物指示剂(已知胞子数量和D值)的类似容器中得到的平均SLR(spore log reduction)值进行比较。,残存概率法,根据生物指示剂
21、的致死效果，估算出实际污染菌的下降水平: SLR A=SLRB DB/DA SLR A灭菌前产品中污染菌的对数下降值SLR B生物指示剂的对数下降值DA灭菌前微生物的(已知或假定的)D值 DB生物指示剂D值。,如果DA=0.5分钟，DB=2.0分钟，121 F0=8分钟，SLRB= 4，则:SLR A=16, SLRA=4 (2.0/0.5)=16 lgNT =1gN0-SLR =2-16=-14, SAL=14。,残存概率法,在灭菌结束时仍有一部分生物指示剂未被杀灭，但这并不意味着此灭菌程序无效。通过它们，证实了测温探头指示的F0值（8分钟)所赋予容器内物品的实际灭菌效果。,残存概率法,只要
22、对灭菌前的含菌量进行控制、监测并掌握其耐热性，一般是不会含有耐热芽胞的控制手段对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。样品须作需氧菌总计数将检品液置于100下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢存活须对微生物学检测结果进行趋势分析以确保半成品的微生物处于稳定的受控状态,残存概率法,一般情况下，暴热后的样品中是检测不到微生物的，一旦发现，则需对其鉴别并测定其D值。若分离菌的D值大于灭菌工艺验证所用生物指示剂的D值，则说明灭菌程序不充分，应采取措施以消除产品中的耐热菌。如果这些措施不可行，则应采用具有更强耐热性的生物指示剂，或是从产品中分离出的耐热性微生物，对灭菌程序进行再验证。,生
23、物学验证就是要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性。过度杀灭法：一般选择嗜热脂肪芽孢杆菌 。 残存概率法：一般选择梭状芽孢杆菌,液体产品在121灭菌15分钟(药典推荐的常用灭菌工艺)即被认为过热灭菌工艺。对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达到过热灭菌要求（ 121灭菌30分钟）。每个指示剂的芽胞含量通常在105-107之间生物指示剂有效性当F0值 (DlgN0-2)时，生物指示剂均应呈阳性结果当F0值 (DlgN0+4)时，生物指示剂均应呈阴性结果,生物指示剂,要掌握灭菌前产品中污染菌状况，污染菌
24、的数量及其耐热性;测定生物剂在待验证产品及验证用标准溶液中的耐热性(D值和Z值);根据产品的最低灭菌工艺条件、灭菌前产品中的污染菌控制要求及最终产品的无菌保证要求，用相关公式计算出验证时每个生物指示剂所需要的胞子数量。,生物指示剂,58,原料药/赋形剂量微生物检查,灭菌前含菌量限度以及污染菌的耐热性限度均是以原材料的微生物含量和常规监控资料为基础而建立的;灭菌条件及F0值控制是根据产品稳定性研究资料而建立的;验证用芽胞在每种产品中的实际耐热性资料由微生物实验室测得。,logN0 = F0/D121 +logNtNt = 2.303 log(n/q)n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后
25、呈阴性的BI数量如果全都是阴性,则假定 q = n-1用于计算 Nt,可选择产品B代表上述三产品进行验证产品的规格相同、且在同一灭菌设备内灭菌并且灭菌工艺条件相似、以及生物指示剂芽胞在其中的耐热性也较为相近，只要验证其中的一个产品B即可，生物指示剂在其中的耐热性最高，而灭菌程序的F0值的下限低于其它二产品但验证时要以100CFU/瓶作为污染菌含量通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降 8个对数单位, 所需F0为 D121 log = 7.2分最低F0满足要求确定验证用芽孢在每瓶产品B中的接种数量,验证标准溶液为氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS)，验证试验瓶数量为20袋/次。，产芽胞梭状菌芽胞在
26、氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.0)中的耐热性为1.4分钟，高于其在产品中的耐热性，接种量: F0=D121(1gA-1gB) 根据阴性分数法，B=2.303 log(n/q)假如所有的20只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时可假定只有19瓶呈阴性，那么，B=2.303lg(20/19)=0.0513,lgB=-1.29,lgA=F0/D121+lgB=8/1.4-1.29=4.4, A=104.4个菌.每个挑战瓶内的芽胞接种量可控制在104105之间。,验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔
27、室，又要尽可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口(干热灭菌的排风口)等应将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相关性资料放置在每个位置的生物指示剂均应做好标记，并且要与验证文件中生物指示剂的验证分布图相对应,验证时，采用相关产品的最低灭菌条件进行灭菌处理灭菌程序结束后，将生物指示剂取出并清点数量并确认无误后，送至微生物室，于适当条件下培养检查。阳性对照以及培养基的灵敏度。在初始验证阶段，分别用生物指示剂在相同的灭菌条件下至少连续运行3次，以评价灭菌工艺条件的稳定性;在以后的定期再验证中，每次检测一批即可。验证时的生物指示剂
28、分布、腔室内的产品装载及指示剂的控制要求均与过热灭菌工艺验证时生物指示剂的使用原则相同。,与过热灭菌工艺相比，残存概率灭菌工艺的灭菌效力相对较低，用商购的普通生物指示剂无法实现对残存概率灭菌工艺的验证。商购的生物指示剂一般用于验证F0值大于等于15分钟的灭菌工艺，而且在载体上的耐热性与在实际产品中的耐热性有相当大的差异。直接将芽胞加到产品溶液内，因其耐热性较高，只能加人较少数量(如Dl21值为2.4分钟，则单位验证产品中的胞子数量只能控制在100个左右才可能被完全杀灭)，这就难以直观反映实际灭菌工艺的可靠性和稳定性试验表明，嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞在孢子纸条或注射用水中的耐热性(D121)约为1.
29、5分，但在乳剂内的耐热性约为2.4分钟。,在同等条件(介质和温度)下，产芽胞梭菌芽胞的耐热性D121值在0.8-1.5分之间，并且它的耐热性也比较稳定。当验证F0值在8 12分钟的残存概率灭菌工艺时，根据产芽胞梭菌芽胞在实际产品溶液中的耐热性，可将单位验证产品中的孢子数量控制在l06个以上。因而能较直观表现实际灭菌工艺的灭菌效果。并非所有灭菌工艺都必须在最苛刻条件下进行验证，而是以灭菌工艺的实际条件及验证合格标准来制定适当的生物指示剂验证方案，从而证明相关产品灭菌工艺的可靠性,湿热灭菌特点,蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而杀灭细胞 蒸汽热穿透性强 灭菌效率高温度相对较低灭菌时间相对短灭菌
30、过程不产生任何化学物理污染灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理,灭 菌 柜 验 证,干热灭菌要点,干热灭菌的介质通常是热空气用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差温度高，200 以上，有可能到320 用于玻璃容器、手术器械等无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源,灭菌过程的Fo 示意,混合蒸汽-空气灭菌器该型灭菌器配有灭菌腔体、离心风机、热交换器、隔板，并连接压缩空气、蒸汽/纯蒸汽、真空泵等。当蒸汽进入灭菌柜时，风机将蒸汽和灭菌器内的空气混合并循环，将产品和空气同时灭菌。蒸汽中加入空气，即可产生一个高于一定温度下饱和蒸汽压的压力。与饱和蒸汽灭菌相比，它的热传递速率较低。,混合蒸汽-空气灭
31、菌器,混合蒸汽灭菌柜,SAM= steam air mixture蒸汽空气混合灭菌柜混合汽体灭菌柜进蒸汽的管没画出顶上用一风扇，使灭菌均匀无风扇时，灭菌容易不均匀热交换器控制冷却速度,下排式蒸汽灭菌柜,热蒸汽在上冷空气在下蒸汽挤空气,用于实验室,脉动真空式蒸汽灭菌器是药品生产中所采用的最典型的高压蒸汽灭菌器，通常由灭菌腔体、密封门、控制系统、管路系统等组成，并连接压缩空气、蒸汽/纯蒸汽、真空泵等。在灭菌阶段开始之前通过真空泵或其他系统将空气从腔室移除，然后通入饱和蒸汽，反复进行真空、通入蒸汽，将空气彻底置换后进行灭菌。灭菌器设有真空系统和空气过滤系统，灭菌程序由计算机控制完成，腔体内冷空气排除
32、比较彻底；具有灭菌周期短、效率高等特点。脉动真空式蒸汽灭菌器对物品包装、放置要求较宽，且真空状态下物品不易氧化损坏的特点，常用于对空气难以去除的多孔/坚硬装载进行灭菌，尤其适用于可以包藏或夹带空气的装载物，比如软管、过滤器和灌装机部件。,脉动真空式蒸汽灭菌器,脉动真空蒸汽灭菌柜,有高真空及脉动真空二种形式第二种比较常见抽99%，剩1%3次真空，残存的空气为0.1%,密封圈,喷 淋 灭 菌 柜该类灭菌器配置有热水储罐、热交换单元、循环风机、循环泵、旋转装置等。灭菌时，产品被固定在托盘上，灭菌水开始进入灭菌腔体，通过换热器循环加热、蒸汽直接加热等方式对灭菌水加热，喷淋到灭菌。灭菌结束后灭菌器可以对
33、灭菌水进行回收。部分工艺可以通入无菌空气，加热循环、除水等工艺对产品进行干燥。这类过热水循环的灭菌程序都使用空气加压，保持产品的安全所需要的压力。优点是加热和冷却的速率容易控制，通常适用于软袋制品的灭菌。,喷 淋 灭 菌 柜,旋 转 喷 淋 灭 菌 柜,干 热 灭 菌 柜,常见程序：1802小时，细菌内毒素下降3对数单位,隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图,瓶清洁,排水汽,预热,去热原,冷却,干热灭菌,层流保护,洗瓶及灭菌、去热原为联动线,B区,冰浴0.01,油浴121,数据采集器,参照仪,验证仪校准,灭菌柜热分布验证试验图示,灭 菌 柜 验 证,灭菌程序的效力测定 生物学手段 用特定的生物指示剂作为
34、标准微生物制剂 数据直接反映灭菌效果 有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶) 局限性：较难进行统计学分析 物理/数学手段 用灭菌值F0作为评价标准 精确测定热分布和热穿透状况 便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果 测量数据便于统计学分析,灭 菌 工 艺 验 证,灭菌工艺验证前提灭菌设备的安装确认灭菌设备的运行确认灭菌工艺的验证先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准空载热分布找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验产品获得的F0生物指示剂验证-微生物挑战性试验灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等）灭菌设备和灭菌工艺的验证,灭菌工艺验证方案.,常
35、包括以下内容:1.灭菌设备的构造概述(包括生产商和型号、设备结构图、运行流程图、工艺制控制流程图等)。2.所使用的具体灭菌工艺(如饱和蒸气、水浸没、水喷淋等方式)3.灭菌工艺参数和运行的标准(如温度、压力、时间、最大及最小Fo值等)。4.被灭菌物品(如装载方式、产品组分、容器大小、灌装体积、最大及最小装载量等)。,5.灭菌工艺的监控方法(如测温探头、模拟瓶、生物指示剂的数量及位置以及合格/不合格标准)。6.关键参数的最大/最小允许范围。7.自动及手动控制的操作步骤。8.验证时异常情况下的记录清单。9.产品所能承受的灭菌致死范围(F0值范围)。10.物理验证试验方法(热分布、热穿透试验)。11.
36、生物学验证试验方法(生物指示剂的选择及使用方式)。12.对灭菌工艺偏差所进行的统计学评价要求及方法,验证试验在确立一个灭菌工艺的灭菌终点时，必须要考虑相关的生物学和物理学因素。了解灭菌设备的运行特性对因素的影响。采用12个以上热电偶/热电阻探头测试.测试前所、后有探头校正，一般0和125 两点校正，在121校正确认，要求与标准温度差值在 0.5之内。每种方式找出设备的“冷点”和“热点”。,1)整个灭菌腔室内的温度探头应均匀分布，将水平和垂直区均覆盖在内。 2)说明温度探头在腔室内的数量及位置，并有图示。 3)在排水口处，在靠近设备本身的温度传感/控制器的位置，应再放置一支探头。 4)在灭菌温度
37、稳定期，各处温度应基本保持一致(各点之间的温差在1范围内,与腔室平均温度间的差值及与灭菌柜设定温度的差值)。（121 ，12分，fo=12，9.5 15.1） 5)重复试验至少3次，以证明在该工艺条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符。,(一) 热分布试验,1.空载状态下的热分布试验,2.每种装载方式下的热分布试验。不同装载方式对产品的热力学效果的影响. 在产品容器内以及腔室内均匀放置测温探头以确定在装载状态下升温最缓慢的位置。此试验应在最大和最小装载方式下分别进行。 1)保温阶段的最高和最低温度(温度范围)及平均温度 2)最小和最大F0值 3)保温时间 3.复试验3次，以证明在该工艺
38、条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符。探头放在产品外面，不与产品接触,(二)各种装载方式下的热穿透试验,通过在产品容器内均匀分布测温探头以确定在灭菌时相应装载方式下的冷点。应分别在最大和最小装载方式下进行此试验，以确定不同装载方式对被灭菌物品的热力学效果的影响。通过实验应能获得如下数据:各点间的最高和最低温度(温度范围)保温阶段各点的平均温度各点的最小及最大F0值各点的保温时间。,通过热穿透试验应达到以下目的:,1.测试数据应证明，在灭菌保温阶段整个腔室内各容器内的温差应不超过土l ，各容器内温度之间的最大温差应不超过2。2.根据灭菌参数确定合适的产品灭菌程序。3.至少连续运行3次，
39、以确保设定灭菌程序的稳定性和可靠性。 对于大输液产品及高粘性的液体产品，必须对容器内的冷点进行测试。对旋转灭菌釜可以不用考虑容器内的冷点,生物指示剂验证 - 过度杀灭工艺,选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂（ B. stearothermophilus ATCC 7953 被视为标准菌株 D121.1= 1.5分，单位数量105 106个孢子）生物指示剂与温度探头并列在同一部位(10-20支)按规定条件培养生物指示剂，如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为 55-60oC，培养 7天，每天检查。对生物指示剂用培养基进行促生长检查进行阳性对照试验所有经受挑战试验的样品均呈阴性,生物指示
40、剂验证 非过度杀灭工艺,选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂生物指示剂的耐热性不得低于孢子在相应产品中的耐热性不得低于产品中污染菌的耐热性用于每次挑战试验的所有BI批号必须相同.生物指示剂的接种量计算F0 = D121.1 ( logN0 - logNt ),指示剂数量为20支左右。BI的D值是在被验证产品中的D值。与热穿透试验同时进行，放置在探头附近。结果能与热穿透保持一致。所有测试点均应确保 SAL不低于 6。重复三次。,生物指示剂测试,再 验 证 和 变 更 管 理,再验证进行再验证的条件设备、产品、工艺有重大改变，或设备有重大维修定期的常规再验证（一次/12月）验证方法
41、通常与初次 PQ 方案相同。变更管理有相关SOP来评价变更对工艺的潜在影响根据变更评估结果确定再验证的范围,用相同的方法对干热灭菌设备进行验证试验，在保温期间各点间的温度差较湿热的要高，如在强制对流式或隧道式干热灭菌条件下，各点间温差会达到士15。与湿热灭菌相比，干热灭菌设备内不同类别的装载物及其装载方式，对热穿透效果的影响要大得多。,当生物指示剂经受挑战试验后，宜在4小时内培养。从质量保证角度来看，我们应当尽可能地在较短时间内培养经受挑战后的生物指示剂。每个企业应根据自身的条件和特点制定适当的时间限度。 对一特定的灭菌工艺，尽可能购买同一类型的生物指示剂，减少生物指示剂的质量复核及灭菌工艺验
42、证评价方面的工作量。实验室自制生物指示剂时，记录均应具有可追溯性，如种源、转种时间、传代代数、培养及制芽胞用培养基和芽胞收集前后的热处理方式等。参照实验室菌种制备、保藏和使用要求管理灭菌工艺用生物指示剂。,要根据灭菌方式及工艺条件选择适当的生物指示剂。事先要了解生物指示剂对相关灭菌工艺的耐受性能，以保证所用生物指示剂的挑战性大于自然存在于产品内(或外)的微生物的挑战性。 生物指示剂对灭菌工艺的耐受性，与灭菌时其所处的环境条件，如生物指示剂包装材料对杀菌剂的穿透效果，芽胞溶液的pH值、粘度、金属离子的浓度等都是生物指示剂耐受性的主要影响因素。如果因产品对灭菌条件敏感而无法采用过度灭菌工艺，则要根
43、据灭菌前产品的含菌量资料来制定合理的灭菌工艺条件和选择适当的生物指示剂。,测试两个样品，分别在121暴热不同时间。测定微生物含量，平皿计数法或经薄膜过滤。残存微生物(Ns)均值取常用对数(lg)，并对相应的曝热时间u(以分钟为单位)作图，可得到存活曲线。计算:Dl21u(1gN0lgNs)曝热5min，lgN0为5，lgNs为2，则Dl215(52)1.7min。D值为存活曲线斜率的负倒数(1K)。用线性回归方程，u为曝热时间(min)，y为存活菌落数的平均值，n 指实验组数。,一次加热就可估算出 D 值。将一组样品(至少10 个样本)置于设定灭菌温度下，加热到设定时间后，取出并分别作无菌检查
44、。该方法检测灵敏度高于平板计数法。DT=ulg10N01g2.3031g10(nq) 式中n样品总数，q曝热处理后的无菌样品数，如果全都是阴性,则假定 q = n-1用于计算 Nt 。,每组至少需要10 个样品，将其置于预定温度下，设置不同的曝热时间，但曝热的时间间隔相同，无菌培养基中，培养结束时，记录每组样品中没有微生物生长的样品数。芽胞完全杀灭(残存芽胞数小于1)时间(T)可用下式计算: T=Tk-d/2-(d/10)xF其中，Tk指阴性分数范围的下限(全部不生长微生物所需最短时间)，d指暴热时间间隔, F每组中无微生物生长样品数。,选择全部生长组(0/10)中暴热时间最长者到全部不生长组
45、(10/10)中暴热时间最短者之间的的数据计算D值。两个时间分别是5分钟和15分钟。芽胞完全杀灭(小于1)时间(T)可用下式计算: T=15-2/2-(2/10) x 26 = 8.8分钟假设N0=105，则D=8.8/ (5+0.2507)=1.7分钟,在湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的z值在8-12之间，计算时z通常取10；在干热灭菌条件下，Z通常取20，去热原时Z通常取54 。分别测定同一种微生物在不同温度下(其他实验条件相同)的D值，以log10D与对应温度作图，就可以得到一条直线。此直线斜率的负倒数即为温度系数-Z值，它反映了微生物的致死性随温度变化的特性。 Z=（Tl-T2)/log10 (D2/D1)，其中，D1指温度为T1时的D值，D2指温度为T2时的D值。,
