1、病毒感染的实验室诊断,病毒感染的实验诊断方法,病原学诊断 病毒分离培养显微镜检查抗原检测核酸检测血清学诊断 抗体检测 IgM、IgG,一、标本采集与运送,（一）标本采集采集时间：尽早采集（越早越好）标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择,（二）标本的运送与保存,1.低温送检 4可保存数小时-70可长期保存 -10 -20下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本对冷冻标本应避免反复冻融2.保湿送检50%甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hanks液3.无菌送检 抑制细菌生长 100U/ml青霉素100g/m
2、l链霉素 抑制真菌生长 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素,二、病毒的分离与鉴定,（一）病毒分离和鉴定的一般程序,（二）病毒的分离,组织培养鸡胚培养动物接种,1.组织培养,将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。组织培养的类型（1）组织块培养（2）器官培养 人胚气管呼吸道病毒；人胚肠肠道病毒（3）细胞培养 最常用原代和次代细胞培养 二倍体细胞培养传代细胞培养,动物新鲜组织（人胚肾等）胰酶消化营养液培养单层细胞（原代细胞） 原代细胞胰酶消化转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传23代。二倍体细胞株 原代细胞反复传代（
3、5070代）仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。,原代和次代培养细胞,2. 鸡胚培养,常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养接种途径及方法 新鲜受精卵 接种病毒,3839713d,卵黄囊接种羊膜腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种,绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤,3. 动物接种,常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小
4、鼠脑内接种柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种乙肝病毒 黑猩猩静脉注射流感病毒 鼻腔滴种用途分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清,（三）病毒的鉴定,病毒的初步鉴定动物感染范围及潜伏期对鸡胚的敏感性在细胞培养中的表现理化性质的测定最后鉴定血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等分离的新病毒，必须进行系统的鉴定,病毒在细胞培养中的表现,（1）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红,病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发生不同程度改变，这种由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为细胞病变效应。,（2）细胞病变效应（cytopathic e
5、ffect ，CPE）,细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。 某些病毒感染细胞后不出现CPE,（3）空斑现象,空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒感染 所致，利用空斑可纯化病毒。 不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定病毒。,（4） 干扰现象当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。,（5）红细胞吸附及吸附抑制试验,受感染的宿主细胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附鸡、豚鼠或猴红细胞 如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清，则不出现红
6、细胞吸附现象，即红细胞吸附抑制试验阳性,（6）血凝及血凝抑制试验,含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于分型。,病毒的理化性质测定,主要用于新发现病毒的鉴定（1）病毒的大小及形态 电镜直接观察（2）核酸类型 5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑制DNA复制，而不抑制RNA病毒。（3）乙醚敏感试验 有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸试验 肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活,病毒的血清学鉴定,中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等,三、病毒的血清学诊断
7、,单份血清IgM测定 早期诊断双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义,病毒血清学试验常用方法,（一）中和试验 原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.Ab 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。 中和试验的必要条件： 1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物,中和试验的常用方法：固定V.，稀释血清，测定抗体效价 （常用）固定血清，稀释V.，求中和指数中和试验的优缺点特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。检测IgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。,（二）补体结合试验,检测IgM，常
8、用于早期诊断。不需活细胞，比中和试验简单，省时。（三）IF及ELISA方法简单、快速、敏感性高。,四、病毒感染的快速诊断,（一）病毒的形态学检查 1.光学显微镜检查 病变组织中找包涵体。 简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体,2. 电镜及免疫电镜检查,直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（106/ml）免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）,乙型肝炎病毒电镜图,轮状病毒电镜图,（二）病毒抗原检查,用免疫标记技术检测： DFA、IFA、IEA等可检测细胞内、外的游离病毒抗原。敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性疾病的早期快速诊断。,Influenzavirus A培养物DFA染色阳性,Influenzavirus B培养DFA染色阳性,生殖道HSV-2涂片DFA染色阳性,（三）病毒核酸检测,多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的病毒基因片断。敏感、特异、简便、快速，标本用量少。核酸电泳技术核酸杂交技术PCR基因芯片技术,（四）早期抗体检测,检测特异性IgM。,IFA检测血清SARS-CoV IgM抗体阳性,
