1、第五章 植物脱毒技术,病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，给马铃薯生产带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。 全世界已发现植物病毒有近700种。病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。,一、植物病毒的危害,一旦染毒，终生带毒； 难用药剂控制； 通过嫁接或虫媒传播，随着无性繁殖系数增大而传播加快； 严重影响作物产量与产品质量； （尤其是一些潜隐性病毒危害更大）如：苹果锈果病、花叶病，香蕉束顶
2、病，草莓斑驳病，马铃薯卷叶病，枣疯病 etc.,植物病毒的危害特点,使用无毒种苗 严格检疫 清除传毒源 防治传播虫媒 无毒种苗培育途径： 群体中未受病毒侵染的植株无性繁殖获得。 种子繁殖获得。但后代往往会发生变异。 组培脱毒培育无病毒苗。能相对保持物种遗传稳定性。,防治策略：,二、无病毒苗培育的意义,1.无病毒苗的定义 指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。2.无病毒苗培育的意义 用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。,1.脱毒的概念 就是指用人为的方法将植物体内的病毒去
3、掉的一种方法。2.脱毒方法：1）热处理法（温热疗法）； 2）茎尖培养法； 3）其它脱毒法。,三、脱毒的概念及方法,1）热处理脱毒（温热疗法）,（1）原理： 当植物组织处于高于正常温度的环境（35-40）时，组织内部的病毒部分或全部钝化，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害，从而达到脱毒的目的。,A.温汤（浸渍）处理： 适用于离体材料（如接穗）和休眠器官的处理。在50左右的温水中浸渍10min至数小时，或在35热水中处理3040小时，使病毒失活。,（2）热处理方法,(1)恒温处理：将生长的盆栽植物移入温
4、热疗室内，一般在3540。对活跃生长的茎尖效果较好，处理时间因植物而异，短则几分钟，长至几处月。处理时，空气相对湿度保持8595。(2)变温处理：如马铃薯每天40处理4h与1620处理20h 交替处理块茎，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持芽眼的活力。 缺陷：方法简便易行，但易使材料受伤，不能脱除所有病毒。例如在马铃薯中只能消除卷叶病毒。 注：热处理需与其它方法配合应用。,B.热风（热空气）处理,热处理时间因植物而异,（1）茎尖培养脱毒原理 染病植株体内病毒的分布不均匀，越靠近茎顶的感染程度越低，生长点（约0.11.0）几乎不含或含病毒很少。原因是无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，不及细
5、胞不断分裂和生长的速度。因此可利用微茎尖培养脱毒。 在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。 茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。,2）茎尖培养脱毒,（2）茎尖培养脱毒方法,1）材料选择、消毒 在植株上直接取或在室内培养一段时间的植株上取顶芽或侧芽（3-5mm），然后消毒。消毒方法是：剪取顶芽梢段35厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%3次氯酸钠或5%7%的漂白粉溶液消毒1020分，最后用无菌水冲洗材料45次。 2）微茎尖的剥取 解剖镜下剥取。注意勿损伤生长点。,3）接种：随剥
6、随接，尽快接种。 4）培养：22左右，每天以1016h、15005000lx光照下培养。保证较高温度和充足光照时间。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。 5）生根培养：诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。,6）培养基 A.常用培养基： MS White、Morel B.提高钾盐的含量会有利于茎尖生长。在用MS培养基时，其中有些离子的浓度过高应适当稀释。 C.严格控制糖浓度，一般2-4%，蔗糖、葡萄糖较好。 D.适当提高生长素（0.10.5mg/L）与细胞分裂素浓度。有时可加活性炭。用NAA或IBA，Kt或BA，不用2,4D。
7、GA适当。7）培养方式 一般用琼脂培养基。对于在固体培养基上易形成愈伤组织的须用滤纸桥。,琼脂培养基培养,滤纸桥培养,（3）影响微茎尖培养的因素,1）外植体大小 通常以带1-3个幼叶原基的茎尖（约0.3-0.5mm)作外植体为宜。不同植物脱毒适宜的茎尖大小不同。 2）培养条件 增加光照 3）外植体的生理状态 茎尖最好在活跃生长的芽上切取，取芽的时间最好是在萌动期较好。,复习思考题,1.热处理为什么可以脱毒? 2.为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的？,3）其它脱毒方法,（1）愈伤组织培养脱毒 将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法，即愈
8、伤组织培养脱毒法。原理： A、愈伤组织分化植株，40%单细胞含有病毒，病毒的复制赶不上细胞的增殖速度。 B、有些细胞经过突变获得了抗病毒性。 缺陷： 后代变异的几率大；有的愈伤组织不能分化成苗。,木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培养，再从成年无病树枝上切取0.4-1.0mm茎尖，在砧木上进行微体嫁接，以获得无病毒植株。果树上应用多。 主要脱毒程序是：无菌砧木培养茎尖准备嫁接嫁接苗培养移植。（3）珠心胚培养脱毒 柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠心胚，因为珠心细胞与维管束无联系，由其产生的植株不易带病毒。,（2）茎尖微体嫁接,（4）化学疗法脱毒,许多化学药品
9、 (包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8氮鸟嘌呤、2硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100g 2硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。,1、直接检查法（非潜隐性病毒的鉴定） 直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。 非潜隐性病毒在植株上能产生明显可见的症状，可分为3种类型：1）叶片变色：主要是由于叶绿素的形成受到病毒的干扰而引起的，叶片表现为花叶或黄花。2）枯斑和组织坏死：3）畸形：果实、枝、叶变形或植株矮化。以上各症状可单独发生，也可混合发
10、生。,四、无病毒苗的鉴定,2、指示植物法,概念：指示植物法就是利用病毒在其他植物上产生枯斑作为鉴别病毒种类的方法。 专门用以产生局部病斑的寄主植物即为指示植物，又称寄主植物。应根据不同的病毒选择适合的指示植物。并且一年四季都可栽培。 特点：条件简单，操作方便，经济而有效，它只能鉴定靠汁液传染的病毒，只能测出病毒的相对感染力。 种类：（1）草本指示植物鉴定方法 1）汁液涂沫法； 2）小叶嫁接法 （2）木本指示植物鉴定方法 1）直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片；2）双重芽接法；3）双重切接法,（1）草本指示植物鉴定方法,1）汁液涂沫法采取汁液在被鉴定植物上取13g幼叶，在研钵中加入10ml水及少
11、量0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），研碎后用双层纱布过滤，再在汁液中加入少量的500600目金钢砂（摩擦剂）。 接种用棉球蘸取汁液在指示植物叶面上轻轻涂沬23次，后用清水冲洗叶面。 培养在防蚜虫温室内培养，1525 ，26天观察病症。,小叶嫁接法,2）小叶嫁接法 指示植物作砧木，被鉴定植物小叶作接穗，常用劈接法。,（2）木本指示植物鉴定方法,木本多年生果树及草莓等无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较困难，则通常采用嫁接接种的方法。以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法为多。,1）指示植物直接嫁接法 预先将指示植物嫁接在实生砧木上，培育一批指
12、示植物嫁接苗。在指示植物基部嫁接上待检测植物的芽，成活后在该芽上方留12个指示植物的芽剪砧，观察重新萌发的指示植物的新稍。2）双重芽接法 将待检测植物的芽嫁接到离地5厘米的砧木上，在待检测植物的芽的正上方1厘米处嫁接上指示植物的芽。1520天接芽成活后，在指示植物芽的上方1厘米处剪砧。将砧木萌孽及待检测植物芽萌发的新梢剪去，以促进指示植物新稍生长。观察新稍症状。 （p150图56）3）双重切接法（p150图55）,3、抗血清鉴定法,植物病毒作为抗原，给动物注射后会在血清之中产生的抗体称抗血清。抗原与抗体间能发生高度专一性的血清学反应（免疫反应）。这样就可用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类，是目
13、前最有用的方法之一。 特点：特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可以完成。 方法： 1）抗原的制备 2）抗血清的采收，分离 3）贮存-15至-25的冰冻条件下。 4）鉴定凝聚反应。（酶联免疫法最常用）,酶联免疫鉴定法,含义：酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。方法：将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。特点：此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。,4、电子显微镜检查法,由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，只有供助于电子显微镜才能分辨0.5m大小的病毒颗粒。这样采用
14、电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。 这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒，但需一定的设备和技术。,1）双链RNA法 通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定双链RNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。2）互补DNA（c DNA）检测法 也叫DNA分子杂交法，核酸分子杂交。,5、分子生物学鉴定,五、无病毒苗的保存、繁殖和利用,通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴定确系无特顶病毒者，既是无病毒原种。 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快
15、又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用510年。,（1）隔离保存 通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.40.5mm大小的网纱，防止蚜虫进入。也可用盆栽钵。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。,1、无病毒苗的保存,1）低温保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基，也叫最小
16、生长法。2）冷冻保存（超低温保存） 用液氮（-196）保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、聚乙二醇等。（见63页）,（2）长期保存,流程 工作区域第一年 脱毒试管苗 无菌室 第二年 原原种 无菌室第三年 原种 网室或温室第四年 良种 隔离区第五年 商品种 繁殖区 生产 生产大田,2、无病毒苗的繁殖,无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。 生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可感染。 一旦感染，影响产量质量的，就应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。 无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20%50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。,3、无病毒苗的利用,1、说明植物茎尖培养脱毒技术原理及其影响因素2、热处理脱毒原理是什么?3、分别说明植物指示植物法和抗血清鉴定法原理4、查阅资料，了解我国脱毒马铃薯生产状况。5、某地区的一种马铃薯经多年的种植后，植株变的矮小，产量和品质都下降，怀疑是由病毒所至。请你设计一个病毒的鉴定和脱毒的技术方案。,思考题,
