1、实验二 中性粒细胞吞噬功能测定 细菌计数法,一、实验内容,1. 细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能 (小组做),2. 录相免疫反击战,二、目的与要求,1.了解中性粒细胞生物学特性及其意义。,2.熟悉“细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能”试验的原理、方法及用途。,实验原理,中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞；,占白细胞总数的60%70%；,生命周期短，不能分裂，靠“造血”补充；,胞核呈多叶状；胞质内有多种颗粒；,内含髓过氧化物酶、防御素、溶菌酶、组织蛋白酶、乳铁蛋白、碱性磷酸酶等。,中性粒细胞特有，巨噬细胞没有这种酶，为中性粒细胞在细胞化学上的标志。,中性粒细胞通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，吞噬和消
2、化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物；,中性粒细胞产生伪足包围异物吞噬体或吞噬泡；,吞噬呼吸爆发产生大量过氧化物及超氧化物等毒性效应分子杀死吞噬的细菌等异物；,同时，中性粒细胞本身也死亡，成为脓细胞。,吞噬痢疾杆菌,吞噬炭疽杆菌,小吞噬细胞吞噬的细菌,中性粒细胞：,A.在抗化脓性细菌感染中起重要防御作用；B.引起感染部位急性炎症反应；C.参与超敏反应（如III型超敏反应），引起机体免疫病理损伤。,将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内但还未被消化掉的细菌。 检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅助判断机体非特异性免疫力的指标之一。,细菌计数法测定中性粒细胞吞噬
3、功能小吞噬实验,检测指标：,1. 吞噬百分率,100个细胞中吞噬有细菌的细胞数,人吞噬百分率正常参考值：62%76%,100,100%,2. 吞噬指数,100个中性粒细胞吞噬的细菌总数,人吞噬指数正常参考值：1.321.72,100,(1)显微镜、香柏油、小试管、EP管、载玻片、酒精棉球、吸管、水浴箱等。(2)肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。(3)菌液制备：白色葡萄球菌1824小时内汤培养物，经Mc Farland比浊法调整浓度至69109/mL，加热100 15分钟杀死细菌，置4保存备用。,实验材料,(1)仔细消毒后，每个班取5ml静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。,实验方法,(3)取出EP
4、管，用吸管吹打混匀后，取1滴“全血-白色葡萄球菌混合液”置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。,(2) 取2ml抗凝血于EP管内，再加入1ml备好的白色葡萄球菌菌液，充分混匀后，置37水浴20min，中途混匀1次。,(4)待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。,瑞氏染色,瑞氏染液数滴覆盖血涂片上 染色1min 再加等量的PH6.8 PBS与染液混合，染色1015min 用蒸馏水冲洗（平持玻片，在一端加水，使染料“漂走” ） 自然干燥,显微镜油镜原理,显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数 接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 表示显微镜辨析物体（两端）两点之 间距离的能力
5、，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 ) D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,油镜使用的原理 1. 香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。 2 . 提高了显微镜的分辨率,显微镜油镜的使用方法,1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标 本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看 清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后
6、复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的 油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用 擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,油镜观察,首先寻找中性粒细胞观察胞质中有无吞噬的细菌。如染色正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而中性粒细胞胞浆染成淡红色。,计算吞噬百分率和吞噬指数,(1)人类白细胞的吞噬活性在37时最好，温度过高过低均会使其吞噬能力减低。,注意事项,(2)个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。,(4)取“细菌全血”涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。,(3)掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。,中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬5min时吞噬率达45%，10min时接近80%，20min 即达平台。,
