1、实验六 吖啶橙染色检测细胞凋亡,实验目的与要求,1、掌握吖啶橙染色检测细胞凋亡原理和操作方法2、掌握荧光显微镜的原理与操作方法,凋亡的起始：细胞表面特化结构消失，细胞皱缩，内质网膨胀与质膜融合，染色质固缩和降解。凋亡小体形成：细胞核分裂，与细胞质一起形成芽状突起，逐渐与细胞分离。凋亡小体被吞噬：,实验原理,凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。,吖啶橙染色原理,吖啶橙(Acridine Orange) 是一种荧光染料，它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光(约502nm)激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)
2、，核仁和胞质RNA发桔红色荧光(580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。正常细胞核因含DNA显示黄绿色荧光，细胞质与核仁都显示橘红色荧光，细胞体积较大且铺展。凋亡细胞体积明显缩小，核呈黄绿色，断裂为多个碎块状，无核仁，碎裂的核由膜包裹着凸起于细胞表面呈黄绿色。,荧光显微镜,荧光显微镜的成像原理,荧光显微镜是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。物质吸收短波光，发射出的长波光。,反射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜激发滤色镜,分色镜,
3、汞灯,紫外线保护罩,孔径光栏（FS）视场光栏（AS）,落射荧光显微镜各部件特性和作用,汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G),激发滤色镜: 波长选择,nm,T%,BAND PASS,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光,分色镜:反射激发光,透过荧光,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,反射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,滤色镜的选择,激发滤色镜,吸收滤色镜,FITC 吸收,FITC 发射,分色镜,滤色镜：对一定波长范围内的光线进行选择性吸收或透过的仪器。 激发滤色镜： UV:340-380nm
4、 V:390-460nm B:460-500nm G:500-570nm分色镜：将入射光的部分波长范围的光反射，其余部分透过的反射镜。,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收, 取细胞爬片，PBS液漂洗2次，晾干。 95乙醇溶液固定5 min。 滴加0.01吖啶橙染液染色5min。 PBS液临时封固(取1张干净载玻片，滴1滴PBS液，将染色好的飞片细胞面朝下放在载玻片液滴处)，选择紫蓝光激发滤片，荧光显微镜观察。,实验步骤,制备细胞爬片,胰酶消化,盖玻片培养,紫外照射10 min,培养12 h,细胞凋亡的检测：,诱导凋亡,观察：用蓝紫光滤光片，可见经0.01的丫啶橙荧光染料
5、染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(亮绿色或暗绿色、橙红色),反射荧光显微镜的构造,优点： 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。,缺点：在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。,激发荧光的方式： 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 UV激发法是用短于40
6、0nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。,BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。 该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。,用于荧光抗体法的荧光色素，对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的图像。,其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光
7、抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。,荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑： 从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明最好。 以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率最高。,UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小；后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用最适合标本要求的照明法进行观察。,需要注意，即使像反差最佳的UV激发暗场聚光器照明，由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此，必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片（萤石或氟石玻璃）。,
