1、一、发酵过程主要生化指标的测定,发酵液中还原糖的测定直接滴定法,1、 什么是还原糖？,还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类 。关键在于分子中有没有游离的具有还原性的半缩醛羟基。,2、 为什么测还原糖？,还原糖作为重要的碳源，其浓度是控制发酵过程中的重要参数之一。随着发酵过程的进行，发酵培养液中的还原糖被菌体消耗利用，转化成菌体组织或代谢产物。因此，测知发酵过程中还原糖浓度变化，通过定时取样检测发酵液中的还原糖浓度，可以更好的了解发酵进程，以便优化控制发酵生产过程。对发酵控制和发酵终点的判断有重要的指导意义。,3.反应原理,CuSO4+NaOH Cu(OH)2 Cu(OH)2 +酒石酸钾钠 酒石酸
2、钾钠铜络合物(Cu2+)酒石酸钾钠铜络合物+葡萄糖 Cu2O+葡萄糖酸在滴定中Cu2+完全还原后，微过量的葡萄糖也能将弱氧化剂次甲基蓝还原，使之蓝色消失，即达到反应终点 。,4.实验方法,1.空白滴定 精确吸取费林甲、乙液各5mL放入锥形瓶中，加蒸馏水10mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖标准液9mL。摇匀在电炉上加热，沸腾15s后，匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点。记录沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数(A)。,2.预备滴定 精确吸取费林甲、乙液各5mL，放入锥形瓶中，加蒸馏水10mL，再加1mL稀释样液。根据样品含糖量的高低(估计数)，可用糖液滴定管先加入一定量的0.1%葡萄糖液，
3、摇匀加热，沸腾15S后，匀速滴入0.1%葡萄糖液，至蓝色消失即为终点，记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液毫升数，作正式滴定时参考用。,3. 正式滴定(做两个平行实验)精确吸取费林甲、乙液各5mL，放入锥形瓶内，加蒸馏水10mL及1mL稀释样液，再用糖液滴定管加入比预备滴定耗用量少0.5mL左右的0.1%葡萄糖标准液，摇匀后加热，使其在12min内沸腾，沸腾15S后匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点，记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液的毫升数 (B)。,滴定注意事项,至少以1秒1滴的速度滴定 ；滴定在1min内完成；滴定消耗量葡萄糖量控制在1ml以内；做平行测定,两次相差不得
4、超过0.1mL。 沸腾后滴定。滴定终点：一瞬间变成澄清的黄色溶液样品是稀释10倍后的稀释液快到终点时减速，摇晃三角瓶中途不要更换试剂,5. 数据记录,6. 结果计算,按下公式进行计算： (A -B) C还原糖(g/100mL)样品稀释倍数 W式中: A空白滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数，mL; B正式滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数，mL;(取两次平行实验的平均值) C葡萄糖标准液浓度(0.1g/100ml) W参加反应的稀释样液量，mL。,二、发酵过程主要生化指标的测定 氨基氮测定甲醛滴定法,为什么要测定氨基氮？,氨基氮是微生物生长的主要氮源，菌体代谢主要氮源是由蛋白分解形成的单体氨基酸。因此
5、，氨基氮的含量是一项表明潜在的菌体生长和发酵力的重要指标。,三、大肠杆菌发酵种子的制备,菌种 斜面 一级种子 二级种子按学号，4人一组，3组共用一支斜面种子摇瓶装液量50ml一级种子种龄在14h2h内，二级种子7-8h内,30，18h ，4长期保存,14h，32，,8h，32,接种量1-2环,接种量1%,时间安排,无,0,2,无,每一格必须由操作人签名！,无,无,无,无,镜检：革兰氏染色,写上组号，上交，每组交三片，写上时间，组号。作为评分依据。大肠杆菌是G-菌步骤：初染、媒染、脱色、复染1、 涂片固定2、 草酸铵结晶紫染1min3、 自来水冲洗4、 加碘液覆盖涂面染1min5、 水洗，用吸水
6、纸吸去水分6、 加95%酒精数滴，轻轻摇动脱色，30s后水洗，吸去水分。7、 番红染色液染1min，自来水冲洗，干燥，镜检。阳性呈紫色，阴性呈红色。,pH,测量方法：精密pH试纸。pH的变化理论上为：初期，菌体生长期，菌体利用营养物质释放酸，使pH中期，生物合成期，pH相对稳定后期，菌体自溶期，氨基氮，pH,生物量测定浊度法,OD测浊度：分光光度计使用前预热20min。在420nm处测量为了使OD值与浓度成线性关系，应稀释，保证OD值小于0.5，把稀释倍数也记录在表格里，理论上，二级种子结束时的OD应大于一级种子。稀释5倍或10倍甚至更多。灭过菌的空白培养基作参比液,稀释相同倍数。,实验室安排
7、,每组领一台显微镜，放在510接种 502灭菌 504 摇床 505 分光光度计 310,测定原理,水溶液中的氨基酸并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是兼性离子，既是质子供体（酸），也是质子受体（碱）。 COOH COO- COO-H3N+ C H H3N+ C H H2N C H R 2左右 R 9左右 R甲醛可与氨基酸上的NH3+结合，生成羟甲基衍生物，释放出H+ R-NH22HCHOR-N（CH2OH）2,pK1,pK2,沙伦逊甲醛滴定法(Sorensenformaltitration)一种测定氨基或氨基氮的方法。氨基酸分子中含有碱性氨基和酸性羧基，在固态或水溶液中以双性离子（内盐）存
8、在，因此不能直接用酸滴定氨基，也不能用碱滴定羧基。沙伦逊提出了将氨基酸（水溶液）用中性甲醛水溶液处理，将氨基“隐蔽”后滴定羧基的方法。,为何两种显色剂？6-7.6 溴酚兰变色范围（黄 蓝）7.4-10 酚酞变色范围（无色 粉红）酚酞终点淡红，不易观察，现在变色范围是从黄色变为紫色，终点为紫色，易观察。用标准碱液滴定羧基，按标准碱的消耗量求出氨基酸的含量。碱完全中和羧基时的pH值约为8.59.5。,滴定注意事项：,甲醛有毒，滴定要快，必要时可戴口罩。现配现滴，滴完盖紧瓶盖。中性甲醛若长时间放置会变酸,滴定前要重新中和。,数据记录：,计算,V为滴定发酵液时消耗NaOH溶液的毫升数。V0为滴定空白时消耗NaOH溶液的毫升数。1.4008为1ml0.1mol/LNaOH溶液相当的氮毫克数，氨基氮的含量是每毫升中的含量。2是参加反应的样品液的体积.,mg/mL,
