1、免疫学基本知识,山西省疾病预防控制中心吴立平2006.6.11,抗原的概念,抗原(antigen，Ag)是指能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。一个完整的抗原应包括两方面的免疫性质：免疫原性(immunogenicity)指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen)；,抗原的概念,反应原性(immunoreactivity)指抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力，亦称为反应原性。有些物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，称为半抗原(hapten)；而免疫原通常同时具有免疫反应能力。,抗体的概念,抗
2、原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)就是抗体。Ig由浆细胞产生，存在于血液和其他体液（包括组织液和外分泌液）中，约占血浆蛋白总量的20；还可分布在B细胞表面。,抗体的概念,抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克
3、隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。,免疫应答,免疫应答（immuneresponse）是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以排除抗原为目的的生理过程。这个过程是免疫系统各部分生理功能的综合体现，包括了抗原递呈、淋巴细胞活化、免疫分子形成及免疫效应发生等一系列的生理反应。,免疫应答,通过有效的免疫应答，机体得以维护内环境的稳定,免疫应答的基本过程,抗原识别阶段（antigen-recogniting phase）是抗原通过某一途径进入机体，并被免疫细胞识别、递呈和诱导细胞活化的开始时期，又称感应阶段。一般，抗原进
4、入机体后，首先被局部的单核巨噬细胞或其他辅佐细胞吞噬和处理，然后以有效的方式（与MHC类分子结合）递呈给TH细胞。 (TO BE CONTINUE）,免疫应答的基本过程,B细胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直接与抗原结合，并且可将抗原递呈给TH细胞。T细胞与B细胞可以识别不同种类的抗原，所以不同的抗原可以选择性地诱导细胞免疫应答或抗体免疫应答，或者同时诱导两种类型的免疫应答。（TO BE CONTINUE）,免疫应答的基本过程,另一方面，一种抗原颗粒或分子片段可能含有多种抗原表位，因此可被不同克隆的细胞所识别，诱导多种特异性的免疫应答。 (TO BE CONTINUE）,免疫应答的类型,按参与
5、细胞分类： 根据主导免疫应答的活性细胞类型，可分为细胞介导免疫和体液免疫两大类。T细胞介导的免疫应答，简称为细胞免疫，体液免疫是B细胞介导的免疫应答，也可称抗体应答，以血清中出现循环抗体为特征。（TO BE CONTINUE）,免疫应答的类型,按抗原刺激顺序分类：某抗原初次刺激机体与一定时期内再次或多次刺激机体可产生不同的应答效果。据此可分为初次应答和再次应答两类。一般地说，不论是细胞免疫还是体液免疫，初次应答比较缓慢柔和，再次应答则较快速激烈。（TO BE CONTINUE）,免疫应答的类型,按应答效果分类：一般情况下，免疫应答的结果是产生免疫分子或效应细胞，具有抗感染、抗肿瘤等对机体有利的
6、效果，称为免疫保护；但在另一些条件下，过度或不适宜的免疫应答也可导致病理损伤，称为超敏反应，包括对自身抗原应答产生的自身免疫病。与此相反，特定条件下的免疫应答可不表现出任何明显效应，称为免疫耐受。 （TO BE CONTINUE）,免疫应答的类型,另外，在免疫系统发育不全时，可表现出某一方面或全面的免疫缺陷；而免疫系统的病理性增生而称为免疫增殖病。,免疫应答间的关系,免疫学技术,抗原抗体反应,抗原抗体反应(antigen-antibody reaction) 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、
7、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（serologicreaction）。,第一节抗原抗体反应的原理,抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结
8、合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两个阶段难以严格区分，而且两阶段的反应所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开始时抗原抗体浓度较大且两者比较适合，则很快能形成可见反应。,第二节抗原抗体反应的特点,（一）特异性抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。这种特异性如同钥匙和锁的关系。例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部
9、分相同，皆可出现交叉反应。,（二）按比例,在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的反应。 以沉淀反应为例，若向一排试管中中入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线（图1）。,图1沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系Ag：抗原；Ab：抗体,从图中可见，曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence）。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀
10、物形成快而多。其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比（optimalratio）。 在等价带前后分别为抗体过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象（zonephenomenon）。出现在抗体过量时，称为前带（prezone），出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）。,在用沉淀反应对不同来源的抗血清进行比较后，发现抗体可按等价带范围大小分为两种类型，即R型抗体和H型抗体。R型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血均属此型。H型抗体以马免疫
11、血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和许多大动物的抗血清皆属H型。,（三）可逆性,抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为：Ab-AgAb.Ag=k1/k2=k式中各反应项的单位以mol表示，k1表示反应速度常数，k2为逆反应速度常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可知，K值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以K值表示。,（三）可逆性,抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力；二是环境因素对复合物的影响。 反之，低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的
12、结构、活性及特异性。,（三）可逆性,在环境因素中，凡是减弱或消除抗原抗体亲和力的因素都会使逆向反应加快，复合物解离增加。如pH改变，过高或过低的pH值均可破坏离子间电引力消失。对亲合力本身较弱的反应体系而言，仅增加离子强度即可解离抗原抗体复合物的目的；增加温度可增加分子间的热动能，加速已结合的复合物的解离，但由于温度变化易致蛋白变性，所以实际工作中极少应用。改变pH和离子强度是最常用的促解离方法，免疫技术中的亲和层析就是以此为根据纯化抗原或抗体。,影响抗原抗体反应的因素,（一）电解质抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝
13、集物的形成，常用0.85氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（1215mV）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。,影响抗原抗体反应的因素,（二）酸碱度抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为68进行。pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。,（三）温度,在一定范围
14、内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37。每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4 左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。,沉淀反应,沉淀反应是指可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen），可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉
15、淀素（precipitin）。,第一节液体内沉淀试验,一、絮状沉淀试验 将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。,（一）抗原稀释法,将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或37反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。（二）抗体稀释法（Ramon）法用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应 二、环状沉淀试验,第二节凝胶内沉淀试验,用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。,一、单向扩散试验,是在
16、琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。 可分为试管法和平板法两种,（二）平板法,是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是： 将抗体或抗血清混入0.9琼脂糖内（约50），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般直径约35mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37让其向四周扩散，2448h后可见周围出现沉淀环 由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散 单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差（不能测g/ml以下含量）。,二、双向扩散试验,在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗
17、原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。,免疫电泳技术,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析,一、免疫电泳二、对流免疫电泳三、火箭免疫电泳四、免疫固定电泳经典的沉淀试验有4个缺点无法克服，即操作繁琐、敏感度低（10100g/ml）、时间长和难以自动化。,凝集反应,凝集作用（反应）（agglutination）:特异性抗体引起抗原颗粒凝集或形成块状的作用（反应） 。凝集素（ag
18、glutinin）: 凝集素即凝集抗体。在凝集反应中与颗粒性抗原起反应的抗体。凝集原（agglutinogen）: 在凝集反应中，刺激凝集素产生或与抗体反应的抗原，这种抗原通常是颗粒性抗原。,凝集反应的特点,凝集反应的发生分两阶段：抗原抗体的特异结合；出现可见的颗粒凝集。 凝集试验是一个定性的检测方法，也可以进行半定量检测， 凝集试验灵敏度高，方法简便。,凝集反应,凝集反应可分为直接凝集反应；间接凝集反应；自身红细胞凝集试验抗球蛋白参与的凝集试验,是两种特殊的凝集反应,第二节直接凝集反应,细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应（dire
19、ct agglutination）。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。,（一）玻片凝集试验,玻片凝集试验为定性试验方法，一般用已知抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集的为阳性反应。此法简便、快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型。玻片法还用于红细胞ABO血型的鉴定。,（二）试管凝集试验,为半定量试验方法， 常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度。 在试验中，由于电解质浓度和pH不适当等原因，可
20、引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。常用的直接试管凝集试验为肥达试验（Widal test）和外斐试验（Weil-Felix test）。,第三节间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应（indirectagglutination）或被动凝集反应（passiveagglutination）。 其敏感度高于沉淀反应,一、间接凝集反应的类型,1（正向）间接凝集反应用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体： （正向）间接凝集反应原理示意图,（
21、正向）间接凝集反应原理示意图,（正向）间接凝集反应原理示意图,2反向间接凝集反应,用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。,反向间接凝集反应原理示意图,3间接凝集抑制反应,诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体，此时称反向间接凝集抑制反应。,间接凝集抑制反应原理示意图A：标本中含抗原B：标本中不含抗原
22、,4协同凝集反应,协同凝集反应（coaggoltination）与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白（staphylococcusprotienA，SPA）。SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。,中和反应,细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应 (neutralization)中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体，中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结
23、合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和试验可以在敏感动物体内(包括鸡胚)，体外组织(细胞)培养或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应或中和毒素对细胞的毒作用；以及测定抗体的其他生物学效应。,免疫标记技术,经典的三大标记技术：荧光抗体技术、放射免疫分析和酶免疫技术。首先被用作标记免疫技术中标记物的是荧光素； 放射性核素作为标记物在免疫技术中的应用又开创了特异性的超微量测定； 酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的
24、结果。,酶免疫技术,这种标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位，属于免疫组化技术（immunohisto chemical technique）范畴，另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。称为免疫测定（immunoassay）。,ELISA的原理和类型,基本原理：1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。,ELISA的基本原理,使抗原或抗体结合到某种固相
25、载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,ELISA的基本原理,在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。,ELISA,有3种必要的试剂：固相的抗原或抗
26、体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,（一）双抗体夹心法检测抗原最常用的方法,（二）双位点一步法,在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步简化了操作，缩短了反应时间， 它应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。,钩状效应,一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
27、,（三）间接法测抗体是检测抗体最常用的方法,（四）竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体,（五）捕获法测IgM抗体,血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。,ELISA的技术要点,（一）固相载体最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。 聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。 最常用的载体为微量反应板，国际通用的标准板形是812的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。,ELISA的固相载体,好的ELISA
28、板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。 每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。,（二）抗原和抗体,要求：抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。抗
29、原有三个来源： 天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。,抗原和抗体,抗体有多克隆的和单克隆。抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的IgG可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯。,（三）免疫吸附剂,固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。 抗原或抗体固相化
30、的过程称为包被(coating)。通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4过夜，经清洗后即可应用。,包被,如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面没有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高 。可再用15牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温(-20)可放置一段时间而不失去其免疫活性。,（四）酶和底物,最常用的酶：辣根过氧化酶（HRP）:在蔬菜作物辣根中含量很高，是一种糖蛋白. 碱性磷酸酶（AP
31、）:从牛肠粘膜或大肠杆菌提取。从大肠杆菌提取的AP作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。一般用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应。AP敏感性高于HRP，空白值也较低。但AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，国内在ELISA中一般均采用HRP。,HRP催化下列反应：,上式中DH2为供氢体，H2O2为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物 . ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺 （
32、orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3，3 ，5，5-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS2，2-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)。,底物,OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。,HRP催化OPD的反应如下：,（五）结合物,酶标记的抗原或抗体称为酶
33、结合物（conjugate）。制备酶结合物的方法通常有： 1戊二醛交联法 2过碘酸盐氧化法,ELISA测定的注意事项,测定方法要标准化：要使ELISA测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。缓冲液可于冰箱中短期保存，使用前应观察是否变质。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。,（一）加样,ELISA在定性测定（临床标本）中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在非临床标本和半定量的测定中则加样量应力求准确。标本和结合
34、物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。,（二）保温,ELISA中一般有二次抗原抗体反应（二步法），即加标本后和加结合物后；反应的温度和时间严格按规定的要求；保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。(实验室应装空调),（三）洗
35、涤,洗涤在ELISA过程中不是反应，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，在洗涤时应把非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。,（三）洗涤,在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）类物质即可达到去非特异物的目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号；结合月桂酸的为聚山梨酯20 ，在ELISA中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。,ELI
36、SA板的洗涤一般可采用以下方法：,吸干孔内反应液；将洗涤液注满板孔；放置2min，略作摇动；吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为34次，有时甚至需洗56次。,（四）比色,用酶标仪测定结果，准确性决定于：ELISA板底的平整度；ELISA板的透明度；选用的波长是否正确： OPD490/492，TMB450/620或630；酶标仪的质量。,免疫印迹技术,免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗原（抗体）鉴定抗体（抗原）的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有
37、目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,免疫印迹技术,例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体(样品)反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白（样品中的抗体）的位置。免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于
38、比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。,荧光免疫技术,荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。,有关荧光的基本知识,一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐
39、射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。,（二）荧光效率,荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。,（三）荧光的猝灭,荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子
40、的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。 一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。 在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。,二、荧光物质,（一）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：,1异硫氰酸荧光素,（fluoresceinisoth
41、iocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。,2四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）,为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。 3四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodam ineisothio cyanate，TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双
42、重标记或对比染色。,（二）其他荧光物质,1酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。 2镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。,荧光抗体技术,一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记（二）荧光抗体的鉴定,二、免疫荧光显微技术,
43、免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。,（一）标本的制作,标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。标本主要有组织、细胞和细菌三大类 ；组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片； 细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀 ；涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置10保存或立即使用 。,（二）荧光抗体染色,于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用253730min，不耐热抗原
44、的检测则以4过夜为宜。用PBS充分洗涤，干燥。,（三）荧光显微镜检查,荧光抗体染色的标本 ，在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的其作用是提供合适的激发光。,激发滤光片有两种：,MG为紫外光滤片，只允许波长275400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm；BG为蓝紫外光滤片，只允许波长325500nm的蓝外光通过，最大透光度为410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。透光范围为410650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。观察FITC标
45、记物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9。观察RB200标记物时，可选用BG12与OG5配合。,（四）实验的类型,1直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。（本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。,直接免疫荧光法原理示意图,实验的类型,2间接法：可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。,间接免疫荧光法原理示意图3补体结合法：较少应用。4标记法本法用FI
46、TC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。,荧光免疫测定,一、时间分辨荧光免疫测定 荧光素作为标记物的荧光免疫测定易受血清成分、试管、仪器组件等的本底荧光及激发光源的杂射光干扰，使灵敏度受到限制。时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immuno assay，TR-FIA）是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。,TR-FIA的基本原理,是以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全
47、为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。其中增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应完成后，生成的抗原抗体铕标记物复合物在弱碱性溶液中，经激发后所产生的荧光信号甚弱。在增强液中pH可至23，铕离子很容易解离出来，并与增强液中的-二酮体生成带有强烈荧光的新的铕螯合物，大大有利于荧光测量。用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000次的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长镧系荧光。检测灵敏度可达0.21ng/ml。,TR-FIA测定原理示意图,双抗体夹心法TR-FIA反应
48、程序示意图,荧光偏振免疫测定,荧光物质经单一平面的偏振光蓝光（波长485nm）照射后，可吸收光能跃入激发态；在恢复至基态时，释放能量并发出单一平面的偏振荧光（波长525nm）。偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱。利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定（floutescencepolarizationimmunoassay，FPIA），用于小分子物质特别是药物的测定。,放射免疫分析,放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法的灵敏度高达ng甚至
49、pg水平。测定的准确性良好，ng量的回收率接近100。本法特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。,一、基本原理,放射免疫分析的基本原理是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。它的反应式为：,在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的。抗体的量一般取用能结合4050的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的。根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开，分别测定其放射性强度，就可算性结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）的比值（B/F），或算出其结合率B/(BF)，这与标本中的抗量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。,
