1、实训项目十五 内标对比法测定对乙酰氨基酚的含量一、实验目的1掌握内标对比法的测定步骤和结果计算方法。2掌握样品、流动相的处理方法，掌握液相色谱仪维护基本知识。二、实验原理内标对比法是内标法的一种，是高效液相色谱法中最常用的定量分析方法之一。分别配制含有等量内标物的对照品溶液和试样溶液，经 HPLC 分析后，测得上述两溶液中待测组分(i)和内标物( is)的峰面积，按下式计算试样溶液中待测组分的浓度ci 试样 = ci 对照 对乙酰氨基酚（扑热息痛，PCM ）为苯胺类解热镇痛药，是治疗发热、镇痛的首选药物之一。对乙酰氨基酚稀碱溶液在波长 257 nm 附近有最大吸收，可以用于定量测定。在其生产过
2、程中，有可能引入对氨基酚等中间体，这些杂质在上述波长处也有紫外吸收，若采用紫外分光光度法测定含量，方法影响因素较多。为避免杂质干扰，本实验采用 HPLC 内标对比法测定对乙酰氨基酚含量。三、主要仪器和试剂1. 仪器高效液相色谱仪；C 18 色谱柱(4.6 mm 150mm，5m)；电子天平；容量瓶；移液管。2试剂对乙酰氨基酚对照品：非那西丁对照品；对乙酰氨基酚原料药；甲醇(色谱纯） ；重蒸馏水；针头滤器（0.45m，有机系)。四、操作步骤1色谱条件色谱柱：C 18 色谱柱(4.6 mm 150mm，5m)；流动相：甲醇-水(60：40） ；流速：0.6 mL/min；检测波长：257 nm；柱
3、温：室温；进样量：20L。2内标溶液的配制 精密称取非那西丁对照品约 0.2500g，用适量甲醇溶解后加入 100 mL 容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得内标溶液。3对照品溶液的配制 精密称取对乙酰氨基酚对照品约 0.0050g，用适量甲醇溶解后加入 100 mL容量瓶中，再精密加入内标溶液 10.00 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取 1.00 mL，置 50 mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。4试样溶液的配制 精密称取对乙酰氨基酚样品约 0.0050g，用适量甲醇溶解后加入 100 mL 容量瓶中，再精密加入内标溶液 10.00mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1.0
4、0 mL，置 50 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。5进样分析 对乙酰氨基酚对照品溶液经 0.45m 滤膜滤过。用微量注射器吸取滤液，过进样 20L。记录色谱图，重复 3 次。以同样方法分析试样溶液。五、数据记录与处理按下表记录峰面积，按下式计算对乙酰氨基酚的百分含量。W()= 式中 mi 对照 是对照溶液中组分 i 的量。对照品溶液 试样溶液序号Ai Ais Ai/Ais Ai Ais Ai/Ais123平均值六、注意事项1流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；水相流动相需经常更换(一般不超过 2 天)，防止滋生细菌变质。2实验中可通过选择适当长度的色谱柱，调整流动相中甲醇和水的比例或流速，使对乙酰氨基酚与内标物的分离度达到定量分析的要求。3内标对比法是内标校正曲线法的应用。若已知校正曲线通过原点，并在一定线性范围内，则可用内标对比法测定。该法只需配制一种与待测组分浓度接近的对照品溶液，并在对照品溶液与试液中加入等量内标（可不必知道内标物的准确加入量） ，即可在相同条件下进行测定。七、问题与讨论1比较外标法与内标法、内标对比法定量的优缺点。2如何选择内标物质以及内标物的加入量？3实验中试样溶液和对照品溶液中的内标物浓度是否必须相同？为什么？
