1、11.1DNA 重组技术的基本工具1、基因工程又叫做_基因拼接_技术或 DNA 重组_技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性_，从而创造出更符合人们需要的新的_生物类型_和_生物产品_。基因工程的理论基础：（1）所有生物的 DNA 都是以 4 种脱氧核苷酸 为基本单位，构成独特的 双螺旋 结构，且碱基互补配对 方式相同，这为不同种生物的 DNA 拼接成功提供物质基础。（2）所有生物共用一套 密码子 ，为某生物的基因能够在其他生物细胞内 正常指导蛋白质的合成 提供可能。 2、DNA 重组技术需要哪几种工具？ 限制性核酸内切酶、DN
2、A 连接酶、载体 3、限制性核酸内切酶的主要来源是什么？ 原核生物 作用特点是什么？ 识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 识别序列往往有什么特点？ 回文序列 切出的末端分为哪两类？ 黏性末端和 平末端 怎样产生黏性末端和平末端？ 当限制酶在识别序列的中心轴线两侧切开，产生的是黏性末端，当限制酶在识别序列的中心轴线切开，产生的则是平末端 4、DNA 连接酶根据来源分为哪两类？ E.coliDNA 连接酶、T 4DNA 连接酶 作用：将两个 DNA 分子片段“_缝合_” 起来，恢复被_限制酶_切开了的两个核苷酸之间的_磷酸二酯键_。
3、两种酶的共同点？ 都能连接双链 DNA 的黏性末端 两种酶作用的不同点？ E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端，T 4DNA 连接酶还可连接平末端，但是连接效率比较低。 5、切割目的基因和切割运载体的酶必须满足什么要求？ 切割产生相同的黏性末端 6、使氢键断裂的方法有哪些？ 加热、DNA 解旋酶 使氢键生成的方法有哪些？ 氢键的结合不需要酶的催化,适宜的条件下依靠碱基之间的分子间作用力结合. 使磷酸二酯键断裂的方法有哪些？ DNA 水解酶、限制性核酸内切酶 使磷酸二酯键生成的方法有哪些？ DNA 聚合酶、DNA 连接酶等 限制酶和 DNA 水解酶作用特点有什么不同？ 一种限制酶只能识别一
4、种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子，结果是切成两个 DNA 片段，而 DNA 水解酶是水解 DNA 分子的所有磷酸二酯键，使其形成单个脱氧核苷酸。DNA 连接酶和 DNA 聚合酶作用特点有什么不同？ DNA 连接酶是连接两个DNA 片段，不需要模板。DNA 聚合酶是以一条 DNA 链为模板，将单个脱氧核苷酸加到已有链的末端 27、载体常见种类有哪些？ 质粒、 噬菌体和动植物病毒等 应该满足哪些特点？ 有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段插入其中;携带外源 DNA 片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体 DNA 上，随其同步复制；有特殊的标
5、记基因，供重组 DNA 的鉴定的选择。 常用载体质粒质粒是一种_裸露_的、结构_简单_、独立于细菌_拟核_之外，并具有_自我复制_能力的_双链环状 DNA_分子。1.2 基因工程的基本操作程序1、基因工程的基本操作程序包括哪四个步骤 目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 （一） 、目的基因的获取2、主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子_。目的基因的来源？从自然界已有物种中分离出来，也可以用人工方法合成 获取目的基因的方法有哪些 从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增目的基因、人工合成法 3、什么叫基因文库：将含有某种生物不同基因
6、的许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因称为基因文库 包括哪两大类： 基因组文库和 cDNA 文库 基因组文库和 cDNA 文库的差别？文库类型 cDNA 文库 基因组文库文库大小 小 大启动子 无 有内含子 无 真核生物有，原核生物无基因多少 某生物的部分基因 某种生物的全部基因物种间的基因交流 可以 部分基因可以目的基因的获取：根据基因的有关信息：如基因的 核苷酸 序列、基因的 功能 、基因在 染色体上 的位置、基因的 转录 产物RNA 、 基因 表达 产物蛋白质等获取目的基因。4、PCR：是 多聚酶链式反应 的缩写。是一项在生物体外复制特定 DN
7、A 片段的核酸合成 技术。原理：利用 DNA 双链复制 的原理。条件（前提）： 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物 过程：目的基因受热变性后成为 单链 ， 引物 与 单链 结合，在 DNA 聚合酶 的作用下延伸形成 DNA，如此重复循环多次。3方式： 指数 扩增，约为 2n 。6、人工合成法适用条件 ： 基因 比较小， 核苷酸序列 已知。(二)基因表达载体的构建1、基因工程的核心是 基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的是：使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以 遗传给下一代 ，使目的基因能够 表达和发挥作用 。表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基
8、因 启动子：位于基因的 首端 ，它是 RNA 聚合酶 的识别和结合部位，驱动转录产生 mRNA 。终止子：位于基因的 尾端 ，终止 转录 。标记基因：作用是 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 （三）将目的基因导入受体细胞1、转化：目的基因进入受体细胞内，并在 受体 细胞内维持 稳定 和 表达 的过程。 2、将目的基因导入植物细胞的方法有： 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 采用得最多的是农杆菌转化法 ，农杆菌的特点：易感染 双子叶植物 和 裸子 植物，对大多数 单子叶 植物没有感染力；农杆菌的 的 Ti 质粒的 T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞
9、的 染色体 上。使目的基因的遗传特性得以 稳定维持 和 表达 3、将目的基因导入动物细胞 方法： 显微注射 技术。 操作程序：目的基因表达载体提纯 从雌性动物体内取卵 （或受精卵） 显微 注射 受精卵发育 早期培养雌性动物的 输卵管 或 子宫 内 新性状动物4、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 转化：第一步：用 Ca+ 处理，使细胞处于 一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 ，这种细胞称为 感受态细胞 ；第二步：将重组表达载体 DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。（四）目的基因
10、的检测与鉴定1、检测：检测转基因生物 DNA 是否插入的目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。方法：采用 DNA 分子杂交技术 4。 如显示 杂交带 则表明目的基因已插入染色体 DNA 中。检测目的基因是否 转录出 mRNA ；方法：采用 分子杂交技术 。检测目的基因是否 翻译成蛋白质 ；方法：从转基因生物中提取 蛋白质 ，用相应的抗体进行 抗原-抗体杂交 ，若有 杂交带 的出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。2、鉴定：除分子水平检测外，还可以进行 个体 水平鉴定。例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做 抗虫或者抗病的接种实验 ，以确
11、定是否具有抗性及抗性的程度，又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定 转基因产品的功能活性是否与天然产品相同 1.3 基因工程的应用植物基因工程技术主要用于提高农作物的 抗逆 能力，以及改良农作物的 品质 和利用植物生产 药物 等方面乳腺生物反应器的构建：将 药用蛋白 基因与 乳腺蛋白基因 的 启动子 等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的 受精卵 中，然后，将受精卵送入母体内，使其生物发育成转基因动物。用动物器官来解决人类器官移植的问题，最大难题是 免疫排斥 ，利用基因工程方法对猪的器官进行改造，方法是将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制 抗原决定
12、 基因的表达，或设法除去 抗原决定 基因，再结合 克隆 技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。基因治疗是把 正常基因 导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。目前处于初期的临床实验 阶段。1、4 蛋白质工程的崛起1、基因工程在原则上只能生产 自然界中已经存在 的蛋白质, 天然蛋白质的_结构和功能_符合_特定物种_生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。2、蛋白质工程的目标是：根据人们对 蛋白质功能 的特定需求，对 进行分子设计。由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过 基因 来完成。3、天然蛋白质的合成过程：基因-表达（
13、转录和翻译）-形成氨基酸序列的多肽链-形成具有高级结构的蛋白质-行使生物功能 4、蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发-设计预期的蛋白质结构-推测应有的氨基酸序列-找到相对应的脱氧核苷酸序列 55、蛋白质工程是指以蛋白质分子的 结构规律 及其 与生物功能的关系 作为基础，通过 基因修饰 或 基因合成 ，对 现有蛋白质 进行改造，或 制造一种新的蛋白质 ，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在 基因工程 的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。6、蛋白质工程成功的例子不多原因是 蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，这种高级结构十分复杂，而目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还不够
