1、1Cx43 磷酸化及其与 ZO-1、Src 相互作用的研究进展【关键词】 Cx43 磷酸化；ZO-1；Src；缝隙连接 文章编号：1003-1383(2011)04-0496-03 中图分类号：R 33 文献标识码：A doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2011.04.049 缝隙连接(Gap Junction， GJ)是沟通相邻细胞胞质的细胞间通道，介导缝隙连接细胞间通讯（GJIC)，缝隙连接蛋白(Connexin，Cx)是实现GJIC 的结构基础，主要通过对细胞信号的传导来发挥作用。近年来随着分子生物学发展，有学者认为这种传导主要由 Cx43 完成1 。在蛋白翻译后
2、的加工中，蛋白质磷酸化是调节细胞增殖的基础，同时也是调控细胞信号转导的主要方式。研究表明，Cx43 磷酸化对 GJ 通道的组装和决定通道传导特性起重要的作用，影响疾病的发生发展2 。有学者对后发性心肌梗死研究发现，Cx43 与 Src、紧密连接蛋白-1(Zonula occludens-1，ZO-1)之间存在密切相关，它们相互作用对心肌细胞缝隙连接的结构和功能有重要影响3 。本文对近年来 Cx43 磷酸化特点、磷酸化对缝隙连接通讯的影响及其与相关蛋白 Src、ZO-1 相互作用的研究进展进行综述。 一、Cx43 磷酸化特点 Cx43 是由含 2768 碱基对的 3 条互补脱氧核糖核酸所编码的，
3、由387 个氨基酸组成的一种分子量约为 43KD 的磷酸化连接蛋白，包含四个2跨膜区域，一个胞内环( CL)和两个胞外环（EL1-EL2 ）构成。两个二硫键连接胞外环 EL1 和 EL2，便于对接及识别相应的连接蛋白。目前研究发现 Cx43 按照传统的途径合成，即转录后首先在内质网合成，然后通过细胞内运输系统，转运至高尔基复合体进行磷酸化等一系列翻译后修饰，最后在细胞膜上聚集形成 GJ。其磷酸化主要发生在丝氨酸(Serine，Ser)、酪氨酸和苏氨酸等氨酸残基上，从而为 Cx43 的聚集和缝隙连接的形成提供保障。采用磷酸氨基酸序列分析发现，大多数的磷酸化事件发生在Cx43 蛋白的丝氨酸位点4
4、，而当 PP60src 激活时，也可以出现酪氨酸的磷酸化5 。Cx43 磷酸化区域主要是其 C 末端，而它在胞内袢没有丝氨酸残基，目前没有研究报道 Cx43 的 N 末端出现磷酸化。在细胞培养和组织研究中显示 Cx43 的半衰期较短，只有几个小时6 ，提示这么短的半衰期意味着有较高水平的转录后调控。实际上，既往有学者的研究已经发现，在稳态细胞的生命周期中 Cx43 随时发生着不同的磷酸化4，5 。在培养的成纤维细胞中研究显示 Cx43 的磷酸化是发生在其抵达胞膜以前，最初的磷酸化时间出现在其合成早期的 15 min 内6 。这些早期的磷酸化事件功能参与了 Cx43 从内质网到组装成连接子的转运
5、过程，或者 Cx43 连接子从反面高尔基网络离开。在 Cx43 合成过程中，发现有非磷酸化 Cx43 形式存在，提示这些早期的磷酸化事件可能是暂时性的，或者对于其转运至胞膜不是必要的。研究表明在非细胞连接处的Cx43 并不一定进行磷酸化，但是已有大量研究证实缝隙连接处的 Cx43主要磷酸化成 P2 形式，而且不溶于 Triton X-100。这些研究表明 Cx43有磷酸化和非磷酸化两种形式存在，但是主要以哪一种形式存在为主及3哪一种形式功能占优势，目前尚未见有资料报道。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现，Cx43 有多个电泳条带亚型，即迁移速度较快的非磷酸化的 Cx43 亚型(P0 或者 NP)
6、和迁移较慢的磷酸化的 Cx43 亚型（P1 和 P2） 。而用碱性磷酸酶处理后发现原 P1 和 P2 条带迁移到 P0 条带位置，提示Cx43 磷酸化与共价修饰有关4，5 。 二、Cx43 磷酸化对缝隙连接通讯的影响 磷酸化是蛋白转录后加工的一种修饰形式，它是调控细胞信号转导的主要方式，通过蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用，控制着许多细胞内过程。Cx43 是 Cx 蛋白家族最主要的成员之一，它存在于大多数组织细胞中，其磷酸化状态直接影响 GJIC 的功能。有报道表明一些植物性雌激素能抑制细胞 GJIC 功能，并引起 Cx43 的磷酸化状态的改变。Cx43 磷酸化后能够影响在细胞膜上的组装、降解
7、及 GJ 介导 GJIC。有证据表明，Cx43 一些位点的磷酸化可抑制单通道的开放，从而降低细胞间的 GJ 功能。有研究发现，Cx43 S368 位点磷酸化，导致血管平滑肌细胞 GJ 通道关闭，使得通透性减弱7 ，Cx43 S368-C 末端磷酸化增加，心律失常得到改善8 ，Cx43 的酪氨酸位点磷酸化， GJ 通道功能降低9 。Cx43 的 C-末端含有多个 Ser/Thr 和 Tyr 残基，其中的许多位点能与其他调节蛋白相互作用，特别是其磷酸化状态受多种蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶调节，引起 Cx43 构象改变并最终影响 GJ 功能。同时，各种蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶在 Cx43 从生成到降解
8、的不同阶段，包括合成(synthesis)、转运(trafficking)、聚集（assembly）/解聚(disassembly)、更新(turnover)和降解(degradation)以及通道门控(channel gating)等，直4接和/或间接改变 Cx43 的磷酸化状态来调节 GJ 的功能。有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶 C(PKC)都能够通过 Cx43 磷酸化反应保持半通道的关闭10 。这些研究表明 Cx43 的磷酸化与 GJ 的功能密切相关。国内有学者采用免疫印迹技术和划痕标记示踪技术观察心肌细胞 Cx43 的表达和功能变化，发现异丙肾能通过兴奋心肌细胞 2 肾
9、上腺素受体，显著增强细胞间缝隙连接通道的功能，这主要与其快速诱导的心肌细胞内 Cx43-NP 表达的增加有关11 。Axelsen 等12在离体大鼠心脏体外灌流缺血实验中发现，心肌细胞 Cx43 羧基端第 368 位丝氨酸残基( Ser368)发生脱磷酸化12 。章诗伟等13利用乌头碱对培养新生大鼠心室肌细胞 Cx43 蛋白磷酸化影响的研究中发现，心肌细胞缝隙连接通道中的 Cx43 蛋白在 Ser368 位点发生了明显的脱磷酸化。研究显示，缺血诱发心肌细胞间电耦联的失衡与 Cx43 广泛脱磷酸化、缝隙连接电导下降甚至通道关闭有关。因此，推测 Cx43 发生脱磷酸化可能也是疾病发生、发展一个重要
10、作用机制。 三、Cx43 与 ZO-1、Src 相互作用 ZO-1 和 Src 是最典型的 Cx43 结合蛋白，它们之间相互作用对缝隙连接通道功能有重要影响，与多种疾病密切相关。ZO-1 蛋白是一个 220 KD 的膜周边蛋白，是膜相关鸟苷酸激酶蛋白家族（membrane-associated guanylate kinase，MAGUK）的一个成员，含有 PDZ 结构域、SH3 结构域和 GUK 结构域的复合体。通过其 PDZ 结构域可与其他许多细胞连接蛋白如跨膜蛋白、与肿瘤细胞的浸润和转移相关的 A 辅肌动蛋白-4、肌动蛋白、紧密连接相关激酶、A 连锁蛋白、扣带素等相互连接，相互作用，在5
11、细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程中发挥着关键的调节作用14，15 。最近有学者对滋养细胞层分化过程的研究发现，Cx43 与 ZO-1 之间存在密切相关，相互作用影响 GJ 功能16 。还有学者研究发现，其可通过 PDZ 结构域与 Cx43 的 C 端最末端氨基酸结合，引起通道开启，这与间隙连接斑的形成及稳定性有关。Src 是原癌基因 c-Src编码蛋白质，是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，专一性磷酸化蛋白底物中的 Tyr 残基。从 N-端到 C-端至依次为 N 端豆蔻酰基序列和膜锚定信号的SH4 区、富含脯氨酸的 SH3 区、专一识别并结合含有磷酸化酪氨酸的 SH2区、激酶区及 C
12、端调节区。有学者研究发现 Src 与 Cx43 相互作用途径，首先通过 SH3 区与 Cx43 的脯氨酸残基结合，然后 SH1 区磷酸化 Cx43 中的酪氨酸残基，再通过 SH2 区与磷酸化的 Cx43 结合，引起缝隙连接通道关闭17 。在胞内酸中毒及化学缺血/缺氧情况等异常条件下，对 GJ 处的 Src、ZO-1 与 Cx43 之间的相互作用进行研究，发现高表达 Cx43 的原代星形胶质细胞酸中毒（pH6.5）条件下细胞间 GJIC 明显减少，Cx43 从细胞膜向细胞浆内重新分布，而 ZO-1 仍然停留在细胞内膜上，同时 Src与 Cx43 末端的结合能力增强，导致 Cx43 与 ZO-1
13、解离，从而引起连接通道关闭；化学缺血/缺氧条件则是因为显著诱导了 Cx43 酪氨酸的磷酸化，通过与 Src 的 SH2 区结合，引起通道关闭，细胞间 GJIC 减少18 。Hongwei 等19研究发现，在高血压病晚期，ZO-1 与 Cx43 相互作用降低，Cx43 磷酸化水平下降，出现脱磷酸化，导致心肌电生理改变和心律失常。这些实验研究表明 ZO-1、Src 与 Cx43 磷酸化相互作用将对 GJIC有重要影响。 6综上所述，GJIC 在细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程中发挥着关键的调节作用，其功能异常与多种疾病的发生、发展密切相关。Cx43 磷酸化和脱磷酸化在 GJ 通道的
14、转运、组装、解离、降解以及半通道和全通道的门控等起重要作用，由此影响到 GJIC。Cx43 与其相关蛋白 ZO-1、Src 的相互作用导常可引起的一些相关疾病。目前的研究来看，Cx43 磷酸化及其与相关蛋白 ZO-1、Src 的相互作用在疾病的发生和发展中的作用机制还不是很清楚，有待于进一步研究。 参考文献 1Birgit Ey， Annette Eyking，Guido Gerken，et al. TLR2 Mediates Gap Junctional Intercellular Communication through Connexin-43 in Intestinal Epithel
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