1、1二苯乙烯苷对 SAMP8 鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响【摘要】 目的 观察二苯乙烯苷(TSG)对 SAMP8 鼠脑组织胆碱能神经递质及单胺类神经递质含量的影响。方法 选用 6 月龄的 SAMP8 鼠 50只,随机分为 5 组,SAMP8 对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG 低、中、高剂量组,每组 10 只。另选用 6 月龄 SAMR1 鼠 10 只作正常对照组。各组分别灌胃相应药物 50 天后,采用分光光度法检测各组小鼠脑组织胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AchE)活性,高效液相色谱法检测各组小鼠脑组织去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5 羟色胺(5HT)含量。结果
2、 SAMP8 对照组脑组织 ChAT 活性明显降低,AchE 活性明显升高,NE、DA、5HT 的含量明显降低,与正常对照组比较有显著性差异(P0.05或 0.01);TSG 中、高剂量组 ChAT 活性显著升高,TSG 各剂量组 AchE 活性显著降低(P0.05 或 0.01),NE、DA、5HT 含量均得到提高,与 SAMP8 对照组比较,差异具有显著性(P0.05 或 0.01)。结论二苯乙烯苷可有效促进乙酰胆碱(Ach)的合成及减少乙酰胆碱的分解,促进单胺类神经递质的合成,具有良好的抗痴呆的作用。 【关键词】 二苯乙烯苷;老年性痴呆;胆碱能神经递质;单胺类神经递质 文章编号:1003
3、-1383(2010)04-0381-03 中图分类号:R963 文献标识码:A 2doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.001 阿尔茨海默病,即老年性痴呆(alzheimer eisease,AD)是危害老年人身心健康的常见病、多发病。目前该病的发病机制尚未明确,研究发现 AD与脑内多种神经递质密切相关1,2。二苯乙烯苷(2,3,5,4四羟基二苯乙烯 D 葡萄糖苷,TSG)是何首乌中的主要水溶性成分,近年来发现其具有神经保护作用,对老年性痴呆的防治具有很好的应用价值3,4。本实验从何首乌提取 TSG 成分,以 SAMP8(senescence accele
4、rated mouse prone/8,快速老化小白鼠)为老年性痴呆动物模型,考察二苯乙烯苷对SAMP8 鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响,报道如下。 材料和方法 1.动物 SAMP8 和 SAMR1(senescence acceleratedresistant mouse/1, 正常老化小白鼠)雄性小鼠由天津中医学院第一附属医院提供(实验动物质量合格证号:WJ 津实动质 M 准字第 006 号),SPF 级,体重2428 g。 2.主要试剂 ChAT(胆碱乙酰转移酶)、AchE(乙酰胆碱酯酶)、T.P(总蛋白)测试盒由南京建成生物工程研究所提供。标准品:去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(D
5、A)、5 羟色胺(5HT)标准品(Sigma 公司生产);流动相:甲醇、乙腈(天津市四友精细化学有限公司生产,批号:Q/SHIELD0022000);磷酸氢二钠(广东合山化工厂生产,批号:20060801);样品前处理试剂:高氯酸(广3东爱廉化试剂有限公司生产,批号:060508);阳性对照药:石杉碱甲(豫中制药厂生产,批号:H10940156);二苯乙烯苷(由右江民族医学院生化教研室根据有关文献5,6提取,纯度为 73%)。 3.实验仪器 TU1800 SPC 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);RA50 半自动化分析仪(Bayer Diagnostics Mfg. Ltd)
6、;FJ200 高速分散匀质机(上海标本模型厂);Waters1525 高效液相荧光检测器(美国 Waters 公司);C?18(4.6250mm,5m)色谱柱(Agilent 公司);高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)。 4.方法 (1)动物分组与给药 选择 6 月龄 SAMP8 雄性鼠 50 只,随机分为 SAMP8对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG 低剂量组、TSG 中剂量组、TSG 高剂量组,每组 10 只。另外选择 6 月龄 SAMR1 雄性鼠 10 只,作为 SAMRl 对照组。各组均按 0.2 ml/10 g 体重给药。SAMP8 对照组、SAMRl 对照组:生理盐
7、水,30mlkg-1;阳性药对照组:石杉碱甲 0.02 mgkg-1;TSG 低剂量组:TSG 0.033 gkg-1;TSG 中剂量组:TSG 0.1 gkg-1;TSG 高剂量:TSG 0.3 gkg-1。以上各组每日灌胃给药 l 次,连续 50 天。 (2)标本采集 第 50 天给药 1 小时后处死小鼠,同时迅速剥离小鼠脑组织于 4预冷的生理盐水漂洗除去血液,用滤纸吸干多余水分,分离左右半脑并分别称重,左半脑用于 ChAT、AchE、T.P 测定,右半脑用于NE、DA、5HT 测定。 (3)ChAT、AchE、T.P 的测定 分取出各组小鼠左半脑,分别加入 9 倍4体积的冰生理盐水,用高
8、速分散匀质机制成 10%的脑匀浆,3000 rmin-1 离心 10 min,取上清液待测。按试剂盒操作说明分别对各组小鼠脑匀浆上清液进行 ChAT、AchE、T.P 测定。各组小鼠 ChAT、AchE活性除以相应的 T.P 含量作为 ChAT、AchE 的单位。 (4)单胺类神经递质标准曲线的制备 精密称取 NE、DA、5HT 标准样品各 0.01 mg,分别用流动相定容于 5 ml 容量瓶中,制成 0.002 gL1 的 NE、DA、5HT 的贮存液。按需要稀释成各种浓度进样,每次进样 20 l,以进样浓度(X,gL-1)对峰面积(Y)进行线性回归。 (5)单胺类神经递质测定方法 取出各组
9、小鼠右半脑,分别加入 9 倍量(重量/体积比)5%HClO?4,超声粉碎成 10%匀浆,冷冻高速离心 14000 rmin-1 15 分钟,取上清液进样 20 l。记录各样品的峰面积,代入相应标准曲线计算出相应浓度,统计结果。色谱条件:色谱柱为 Waters symmetry C?18(4.6250mm,5m);流动相 A:磷酸盐缓冲液;流动相 B:甲醇;时间与流速:010 min 0.5 mlmin-1,1014 min1.0mlmin-1,1422.5 min 1.5 mlmin-1,22.530 min 0.5 mlmin-1;A 和 B 泵的比例:9010;AUFS:0.01;波长:激
10、发波长 254 nm,发射波长 338 nm;柱温:35。 5.统计学处理 采用 SPSS 11.0 统计软件包统计分析,计量资料以均数标准差(-s)表示,组间比较采用两独立样本 t 检验,P0.05 为差异有统计学意义。 结果 51.二苯乙烯苷对 ChAT 和 AchE 活性的影响 与 SAMR1 对照组相比,SAMP8 对照组 ChAT 活性明显降低,AchE 活性明显升高(P0.05)。见表 1。 2.NE、DA、5HT 含量的标准曲线制备 根据标准曲线求得其回归方程为:Y=515.6X-38171.9,Y=329.3X-34557.2 和 Y=342.4X+534.5;线性范围分别 1
11、252000 gL-1,1254000 gL-1 和 10500 gL-1。 3.二苯乙烯苷对三种单胺类神经递质含量的影响 与 SAMR1 对照组和阳性药对照组相比,SAMP8 对照组动物 NE、DA、5HT 含量水平明显下降(P0.05 或 0.01)。与 SAMP8 对照组相比,二苯乙烯苷各剂量组能明显升高 NE、DA、5HT 水平(P0.05 或 0.01),其中以高剂量组作用更明显(P0.01)。见表 2。 讨论 AD 是一种以认知功能下降为特征的神经退行性病变,累及多种神经递质系统,其中胆碱能系统活性下降是引起 AD 痴呆表现的重要原因之一 。研究表明,AD 脑内隔区、Meynert
12、 基底核等部位的胆碱能神经元明显减少,AD 患者脑内乙酰胆碱(Ach)合成分泌减少,其合成酶 ChAT 活性下降,且与痴呆严重程度密切相关7,8。AchE 是催化 Ach 水解的主要生物酶,研究证实 AD 脑内一方面正常神经元内 AchE 活性降低,另一方面,神经纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)内游离于神经元外的 AchE 活性显著提高,它们可大6量水解 Ach,使皮质 Ach 活性进一步降低9。而脑内 Ach 含量降低,AchE活性升高,M 和 N 胆碱受体数量减少均可能造成认知功能障碍。 认知机制不仅与胆碱能神经系统密切相关,而且与单胺类神经递质NE、DA、5HT 密切相关。正常情况下,
13、中枢内神经递质的分泌保持在一定水平,它们之间相互制约处于一种平衡状态,从而维持功能的稳定10。研究表明,脑内单胺类神经递质 NE、DA、5HT 等在学习记忆等方面具有重要作用,NE 主要在记忆保持方面起作用,而改善记忆与促进 DA 释放有关,5HT 系统则参与调节情绪、动机和食欲等11。随着机体的老化,会出现学习记忆能力的下降,同时脑内单胺类神经递质的代谢亦发生紊乱,导致NE、DA、5HT 含量的下降,出现痴呆和忧郁等症状12,而改善中枢单胺类神经递质的代谢可弥补或扭转学习记忆的障碍13。 本组实验结果显示,与 SAMR1 对照组相比,SAMP8 对照组 ChAT 活性明显降低,AchE 活性
14、明显升高,单胺类神经递质 NE、DA、5HT 的含量均明显下降。而经二苯乙烯苷治疗后,TSG 各剂量组的 ChAT 活性明显升高,AchE活性明显降低, NE、DA、5HT 的含量均明显提高。提示二苯乙烯苷可促进Ach 合成,减少 Ach 分解,并有效调整中枢单胺类神经递质的合成,通过影响中枢胆碱能神经系统和单胺类神经递质的功能而发挥抗痴呆作用。 参考文献 1Van der Cammen TJ,Tiemeier H,Engelhart MJ,et al.Abnormal neurotransmitter metabolite levels in Alzheimer patients with
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