1、食品微生物学实验,课程简介： 本实验课程主要面向“食品科学与工程”、“食品质量与安全”等专业本科生，以专业基础课程食品微生物学为理论基础，是对学生进行独立的相关微生物研究能力培养的重要环节。共有学时数34学时，教学内容内容包括： “细菌、酵母菌、放线菌等的形态观察”、“培养基的制备和灭菌”等。实验教学包括设计型、技能型和综合型实验内容，可提高学生的动手能力和解决实际问题的能力。,目 录,实验1 显微镜的使用实验2 细菌的形态观察实验3 酵母菌、放线菌形态的观察实验4 霉菌的形态观察实验5 培养基的制备和灭菌实验6 微生物的分离与接种实验7 环境因素对微生物生长发育的影响实验8 细菌鉴定中常用的
2、系生化反应试验实验9 罐头食品的商业无菌检验实验10 几种水产品中的无菌检验实验11 水产品中腐败微生物的分离、纯化及鉴定实验12 红树林环境中抗菌微生物的筛选实验13 果酒的制备实验实验14 乳酸菌分离纯化以及酸奶的研制,实验1 显微镜的使用,1了解普通光学显微镜的各部分构造、性能和基本原理。2学会显微镜的正确使用方法，了解显微镜的维护和保养方法。,【实验目的】,【实验原理】,显微镜的构造：机械部分与光学部分,显微镜的成像原理,光线在穿过折射率不同的介质时发生折射,介质的折射率对光线通路的影响,1显微镜，载玻片，盖玻片。2细菌、霉菌、酵母菌标本片。3香柏油、二甲苯、察镜纸等。,一、实验材料,
3、【实验内容与步骤】,低倍镜观察,调节照明,确定目标,高倍镜观察,油镜观察,镜头的维护,正确放置显微镜,二、显微镜的操作,注意：显微镜结构精密，使用时必须细心，严格按操作步骤进行，具体细节参考实验指导书。,三、 油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。,使用油镜按下列步骤操作,先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地
4、上升（或镜筒下降），使油镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触（约0.2mm）。用粗调节旋钮将载物台慢慢下降，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。,观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。 转动物镜转换器，将各部分还原，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台
5、等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 注意：使用油镜时，在通过目镜观察时，切勿用粗调上升镜台来调节焦距，以免压碎玻片，损坏镜头。,1、如何区别显微镜的低倍镜、高倍镜和油镜？2、 油镜和高倍镜在使用时应注意哪些问题？3、观察完毕后，如何维护显微镜？,【思考题】,实验2 细菌的形态观察,1了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。2初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。3观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。学会初步鉴别微生物的种类的方法。,【实验目的】,1、简单染色法原理 简单染色法是利用单一染料对细
6、菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。,【实验原理】,2、革兰氏染色法原理,电镜照片,3、芽孢染色原理,细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区
7、分芽孢和营养体结构。,4、荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来,细菌荚膜,5、鞭毛染色法原理,细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。 染色成功的关键：一、必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二、是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。,1、简单染色过程,涂片,固定,染色,干燥,水洗、吸干,镜检,【实验内容与步骤】,革兰氏阳性菌（
8、左）和革兰氏阴性菌（右）细胞壁结构的比较,涂片固定结晶紫初染（1min）碘液媒染（1min）乙醇脱色（95%酒精,30s）番红复染（30秒）干燥镜检,阳性菌：紫色阴性菌：红色,2、革兰氏染色过程,革兰氏染色要点,初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗 媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗 脱色：连续滴加95乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗 复染：加番红染色1分钟，水洗 干燥 镜检：先低倍镜，后油镜观察。 注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。,大肠杆菌（G）,枯草杆菌（G+）,金黄色葡萄球菌枯草杆菌（G+）,细菌芽孢,3、芽孢染色过程,操作方法,用枯草杆菌涂片、干燥、固定。 在涂菌处滴加5的
9、孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾56分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。 0.5番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。,4、悬滴法,在盖玻片上滴小半滴无菌水。以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。,5、菌落特征的观察,细菌菌落特征图,实验报告,1绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的个体形态图，并注明三种细菌的革兰氏染色的反应性。2.列表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等三种细菌的菌落特征。,思考题,1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？2.为什么要用培养24小时内的菌
10、体进行革兰氏染色？3.鞭毛染色为何有那么多要求？4.菌体荚膜的成分是什么？为何常用负染色法？5.芽孢染色为何要加热或延长时间？,实验内容与原理,简单染色法原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。,简单染色过程,涂片,固定,染色,干燥,水洗、吸干,镜检,革兰氏染色法原理,电镜照片,革兰氏阳性菌（左）和革兰氏阴性菌
11、（右）细胞壁结构的比较,涂片固定结晶紫初染（1min）碘液媒染（1min）乙醇脱色（95%酒精,30s）番红复染（30秒）干燥镜检,阳性菌：紫色阴性菌：红色,革兰氏染色过程,革兰氏染色要点,初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗 媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗 脱色：连续滴加95乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗 复染：加番红染色1分钟，水洗 干燥 镜检：先低倍镜，后油镜观察。 注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。,大肠杆菌（G）,枯草杆菌（G+）,金黄色葡萄球菌枯草杆菌（G+）,芽孢染色原理,细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料
12、并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。,细菌芽孢,操作方法,用枯草杆菌涂片、干燥、固定。 在涂菌处滴加5的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾56分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。 0.5番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。,荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来,细菌荚膜,鞭毛染色法原理,细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以
13、染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。 染色成功的关键：一、必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二、是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。,悬滴法,在盖玻片上滴小半滴无菌水。以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。,菌落特征的观察,细菌菌落特征图,实验报告,1绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的个体形态图，并注明三种细菌的革兰氏染色的反应性。2.列表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等三种细菌的菌落特征
14、。,1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？2.为什么要用培养24小时内的菌体进行革兰氏染色？3.鞭毛染色为何有那么多要求？4.菌体荚膜的成分是什么？为何常用负染色法？5.芽孢染色为何要加热或延长时间？,【思考题】,实验3 酵母菌、 放线菌形态的观察,1、 观察酵母菌的个体形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2、 掌握酵母菌的菌落特征及其与细菌菌落的区别。3、 学会观察放线菌的菌落特征，个体形态及其繁殖方式。,【实验目的】, 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，多数是圆形或椭圆形，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细
15、胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。 因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。,【实验原理】, 放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。 常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝，基内菌丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝，并进一步分化产生孢子丝及孢子。孢子的表面光滑或粗糙、圆或椭圆，孢子有各种颜色，这些形态特点都是鉴定放线菌的重要依据。,一、实验材料,1. 菌种： 啤酒酵母、面包酵母、裂殖酵母、热带假
16、丝酵母。 白色链霉菌、红色链霉菌2. 0.1%美蓝染液，载玻片，盖玻片,【实验内容与步骤】,1、酵母菌落形态及菌苔特征的观察 观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、热带假丝酵母观察菌苔特征。,二、酵母菌,啤酒酵母菌落,红酵母菌落,各种酵母的菌落,细菌菌落,细菌菌落,椭圆形酵母,2个体形态特征观察,酵母个体形态,酵母菌的芽殖,酵母菌的芽殖过程1泡；2小管；3核；4液泡,酵母菌子囊孢子的形成过程 1、2、3、4：两个细胞结合5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子, 假丝酵母的观察：
17、在高倍镜下观察假丝酵母菌的的假菌丝，菌体呈树枝状分枝。,假丝酵母菌,酵母菌假菌丝的形成 图中1、2、3、4 是出芽的顺序,1. 放线菌落形态及菌苔特征的观察 观察放线菌菌落的表面形状、大小、颜色和边缘等；用接种环挑取菌落，注意放线菌在基质上着生紧密情况。区别基内菌丝、气生菌丝及孢子丝的着生部位，取斜面培养的白色链霉菌、红色链霉菌观察菌苔特征，注意孢子颜色，营养菌丝颜色和色素分泌情况等。,三、放线菌,放线菌菌落特征,放线菌菌丝形态,2个体形态特征观察：用接种铲连同菌苔一薄层培养基取下一小块，平置于载玻片上进行观察，注意放线菌菌丝直径大小，孢子丝的形状。在低倍镜下观察基内菌丝和气生菌丝，在高倍镜下
18、观察孢子丝。,链霉菌形态,放线菌菌丝,放线菌孢子丝,放线菌的孢子丝描绘图,报告内容,绘出啤酒酵母、假丝酵母、裂殖酵母的个体形态图，并标明死活细胞。2. 在同一平板培养基上长有细菌及酵母两种菌落，你如何区别？3. 绘出白色链霉菌的气生菌丝、孢子丝和孢子的形态图。4. 在显微镜下，如何区分基内菌丝和气生菌丝？,实验4 霉菌的形态观察,1学会识别霉菌的菌落特征，掌握霉菌的乳酸石炭酸制片法。2学习观察霉菌个体形态及各种无性孢子的方法。,【实验目的】,霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分支的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。因此，
19、在观察时要注意菌丝直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖形成的孢子是那一种？孢子是怎样着生的？,【实验原理】,1 菌种：毛霉、黑根霉、青霉、黑曲霉。2 乳酸石炭酸溶液、乳酸石炭酸棉蓝溶液，接种钩，接种铲。,一、实验材料,【实验内容与步骤】,二、菌落特征的观察 用肉眼观察生长在PDA琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。,1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。,青霉菌落,曲霉菌落,三、霉菌个体形态的观察,1乳酸石炭酸
20、制片法观察 在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。,A：无隔膜菌丝 B：有隔膜菌丝,霉菌的静孢子左：毛霉的孢子囊；右：囊轴中：孢子囊壁破裂，露出静孢子,曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子,青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子,曲霉的分生孢子头彩图,根霉,毛霉,四、插片培养观察 方法： 将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。2426恒温培养24天。然后，乳酸石炭酸制片、镜检观察。,霉菌的厚垣孢子,孢囊孢子,注意事项,制片时，应用接种铲取菌落边缘
21、处带有孢子的菌丝。取的菌丝或者孢子要少，如果铲太多，反而不易观察。标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。,实验报告,1、绘出毛霉、根霉、青霉和曲霉的个体形态图，并注明各部分名称。2、列表描述上述四类霉菌的菌落特征。3、为何要用乳酸-石炭酸溶液作霉菌水浸片？4、比较霉菌菌丝与假丝酵母菌死的区别。,实验5 培养基的配制与灭菌,掌握培养基的制备方法。 了解高压蒸汽灭菌法的原理，学会干热灭菌和高压蒸汽灭菌技术。,【实验目的】,培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。如按其成分，培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 从营养角度分析，培养
22、基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养菌使用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。,【实验原理】,一、实验材料,药品、天平、称量纸、精密pH试纸量筒、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管、烧杯、试管架、棉花、棉绳、牛皮纸或报纸电炉、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱。,【实验内容与步骤】,二、培养基的制备过程 称药品溶解调pH值过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板,培养基分装,（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培
23、养基： 装载量不超过管长的1/3。 （3）三角瓶：装量不超过容积1/2。, 分装要求, 棉塞的做法, 移液管包扎法, 灭 菌高压蒸汽灭菌法原理：是在密闭的加热容器内进行，加热使容器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100的蒸汽温度,杀灭培养基中所有微生物,达到完全无菌。,高压蒸汽灭菌锅, 斜面的摆放方法,1. 营养琼脂培养基2. 淀粉琼脂培养基3. 马铃薯培养基（一般用于真菌培养）4. 蛋白胨水培养基（用于吲哚试验）5. 葡萄糖蛋白胨水培养基6. 柠檬酸盐培养基 7. 硝酸盐液体培养基8. 明胶培养基9. H2S试验用培养基注意事项 不同用途的培养基，所要
24、求的pH和灭菌温度有所不同。,几种常用培养基,实验报告,（1）记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。（2）试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。,制备培养基的一般程序是什么？试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？3. 分离真菌用的培养基有何特点？,【思考题】,实验6 微生物的分离与接种,学会样品稀释液制备方法掌握稀释平板分离法和活菌计数法掌握平板划线分离法学会无菌操作技术和接种技术,【实验目的】,从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。,需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。,【实验原理】,一、实验材料
25、,培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂培养基）土壤、鱼丸、虾丸、未消毒奶、 90mL无菌水、9mL无菌水无菌平皿、lmL无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔。,【实验内容与步骤】,无菌操作环节,分离接种前，将无菌室、接种室、实验台消毒；进入无菌室前，工作人员应肥皂洗双手，穿戴工作服、鞋、帽。接种的试管、三角瓶作好标记，注明培养基、菌种名称、日期，移入接种室内的物品，需消毒；操作过程不能离开酒精灯火焰，不许交谈；接种工具使用前、后均要经火焰灼烧灭菌。操作动作应正确，轻而迅速。,实验内容与步骤,二、稀释平板分离法,制备样品稀释液,加入15ml、4550培养基，混匀，凝固，制成平板,吸取1ml稀释样液注入
26、相应编号的无菌平皿中,倒置，适温培养(2448h），观察计数,样品稀释液制备流程,称取（吸取10ml ）10g样品,放入装90ml无菌水的三角瓶里,震荡混匀20min ，制成稀释液10-1,用无菌吸管吸取1ml的10-1稀释液，注入装9ml无菌水试管中,制成稀释液10-2,以同样的方法进一步稀释成10-3、10-4、10-5 、 10-6,稀释分离关键操作,每稀释一个浓度，必须更换一支无菌吸管。选取三个高稀释度，每个稀释度制二套平板。吸样时应来回吹吸三次。用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。,样品稀释流程图,稀释平板分离培养的菌
27、落,固体培养基溶化，冷却至50,在酒精灯火焰旁，倒制平板,灼烧接种环取样伸入培养皿轻轻划线,倒置，适温培养(2448h），观察计数,三、平板划线分离法,平板划线分离法,平板划线分离和分区示意图,平板划线分离生长的菌落,在正式作平板划线前，应以空平皿作模拟划线，切实掌握平板划线的要领。平板划线接种环必须圆滑，动作轻巧。挑菌不宜过多,每次划线前必须灼烧接种环。切勿划破培养基。四个区必须分明，第一区不能与第四区相接触。必须在酒精灯火焰旁，以无菌操作划线。,平板划线操作要点,实验报告,1、稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？ 2、观察划线分离的菌落特征，你的划线平
28、板中有无单菌落出现，有多少？ 3、采用菌落计数法，计算出所检样品的细菌总数（活菌数）。,实验7 环境因素对微生物生长发育的影响,1.了解不同环境中微生物的存在，比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。2.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的原理，掌握其试验方法。,【实验目的】,不同环境因素对微生物的生长发育影响不同，同一因素因其浓度或作用时间不同，对微生物的影响也不同，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。 通过本实验了解物理、化学和生物等因素对微生物生长起抑制或杀死的作用，以便对有利的微生物加以利用，而对有害微生物则进行控制或杀死。,【实验原理】,【仪器与材料】,菌种：
29、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、产黄青霉、灰色链球菌。培养基：肉汤蛋白胨培养基（固体和液体）、葡萄糖蛋白胨培养基、豆芽汁葡萄糖培养基。药品：百炎净、新洁而灭、结晶紫（紫药水）、福尔马林、石炭酸等。仪器及其它：水浴锅、黑纸、紫外线灯、接种工具等。,【实验内容与步骤】,1. 环境中生物的检查本实验是检查空气、土壤 、手指、钱币、饭票等处微生物的存在。步骤： 制备肉汤蛋白胨平板分区域用手指、钱币等轻轻在平板上涂抹倒置培养（37，24h）观察记录,手指的实验,未洗的手指,清水洗净的手指,肥皂洗净的手指, 物理因素的影响,紫外线照射的影响 制备肉汤蛋白胨平板，用无菌移液管吸取0.1ml金黄
30、色葡萄球菌或大肠杆菌于平板上，以无菌涂棒涂布均匀，用无菌黑纸遮住部分平板，打开皿盖，置紫外灯下照射25分钟，取出黑纸，盖上皿盖，37培养24 h后观察结果。, 微生物的温度存活试验 根据微生物最适生长的温度范围，可分高温菌、中温菌、低温菌。自然界中绝大部分微生物属于中温菌，但不同微生物对温度的抵抗力不同，特别是芽孢杆菌对温度抵抗力强。, 渗透压的影响 各种微生物都有一个最适宜的渗透压，一般非海洋、非盐湖的微生物在0.85-0.90%Nacl浓度中处于等渗透压状态,各种微生物对不同盐浓度有不同的抵抗力。, 化学因素的影响,化学药物 一些化学药物对微生物生长有抑制或杀死作用。因此在实验室内，生产上
31、或医疗上常利用适宜的化学药品对有害菌进行消毒或杀菌，但应注意药品的浓度及使用时其它因素的影响。,方法：圆滤纸片法,化学药物对微生物的影响, 不同pH对微生物生长的影响 生物因素的影响,青霉素的杀菌过程,实验报告,1记录化学药物对微生物的抑菌圈直径，根据其直径大小，初步比较各种药物的抑菌效能。2比较所培养的不同环境中微生物的菌落特征及数量。3紫外线为何有杀菌作用？经紫外线照射的部分为何会出现异常菌落？,实验8 细菌鉴定中常用的生化反应试验,了解细菌鉴定中常用的生理生化反应试验方法及其原理,【实验目的】,由于不同的微生物具有不同的酶系，其新陈代谢类型不同，所以对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同
32、，可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称为生化反应。 生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物。,【实验原理】,菌种：大肠杆菌、产气杆菌、苏云金杆菌、淡6112、肠细菌。培养基：蛋白胨水培养基、色氨酸肉汤、硝酸盐培养基、 H2S试验用培养基、柠檬酸盐培养基、明胶培养基、淀粉培养基平板。试剂：甲基红试剂、 40NaOH溶液、吲哚试剂、格里斯试剂、二苯胺试剂、碘液。,【仪器与材料】,【实验内容与步骤】,原理：葡萄糖蛋白胨 丙酮酸 甲酸、乙酸、乳酸等桔红色为阳性，黄色为阴性。,1、甲基红试验（M.R试验）,细菌,方法：葡萄糖蛋白胨水生化管 培养 观察结果,37,黄为阴性,原理：葡
33、萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 二乙酰红色为阳性，否则为阴性。,2、V. P 试验,细菌,方法：葡萄糖蛋白胨水生化管 培养 用力振荡 培养,产气杆菌、肠细菌1-2环,37,24h,加1/2培养液的40% NaoH与等量的5% -萘酚,否则为阴性,红色为阳性,缩合,脱羧,加强碱液,37,15-30分钟,M中的胍基,原理：色氨酸 吲哚 + 对二甲基氨基苯甲醛,3、吲哚试验,细菌,E.coil、肠细菌1-2环,37,48h,否则为阴性,红色为阳性,方法：色氨酸肉汤生化管 培养 轻摇静置观察,加23滴吲哚试剂,否则为阴性,红色为阳性,E.coli、肠细菌1-2环,37,48h,注意：加入试剂后不可再摇动，
34、否则被混合，红色不明显。,原理：某些细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐或氨和氮等，当加入格里斯试剂后，亚硝酸盐与其中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，后者与-萘胺结合成为红色的N-萘胺偶氮磺酸，则为阳性反应 .,4、硝酸盐还原试验,E.coil、肠细菌1-2环,37,48h,加格里斯试剂A和B液各一滴,阴性,立即或10分钟红色为阳性,产生杆菌、肠细菌1-2环,37,2-4d,二苯胺和浓硫酸,无兰色为阳性,兰色为阴性,阴性,原理：含硫有机物或无机物 H2S + 铁或铅盐 黑色沉淀,5、产硫化氢试验,否则为阴性,原理：柠檬酸盐 碱性化合物 中性变碱,6、柠檬酸盐利用试验,细菌
35、,原理：明胶是一种蛋白质，有些细菌能分泌蛋白酶（胞外酶）分解此种蛋白，致使失去其本身的凝胶性质，而没有凝固性,7、明胶液化试验,E.coil、肠细菌1-2环,37,48h,方法：明胶液化生化管 培养 观察(4度30分钟),呈固体为阴性,呈液体为阳性,E.coli、产气杆菌1-2环,室温,2-3d,原理：某些细菌能产生胞外淀粉酶，并将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变兰色。,8、淀粉水解试验,【思考题】,1.以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？2.细菌生理生化反应试验中为什么要设对照？,实验9 罐头食品的商业无菌检验,1.了解罐头食品商业无菌检验的基本要求。2.掌握无菌检
36、验的基本程序和结果判定。,【实验目的】,【实验要求与安排】,要求：根据国标检验程序每个小组从准备材料到检验结果要独立完成检验任务，并呈交检验报告。安排：1、根据学号顺序4个人为一个检验小组。 2、每个小组购置四种不同的罐头产品（最好购买到可能会有问题的产品）。 3、 利用课余时间提前准备实验材料，并最终由指导老师确认后方可进行实验室的检验工作。注：因准备与检验工作比较繁琐，所以要分工明确，团结合作才能顺利完成，所以小组长要组织好整个工作。,实验报告,1、写出检验过程。2、呈交检验报告（报告要规范）。,实验10 水产品的细菌检验,1、认识不同水产品的微生物检验项目和指标，了解水产品的卫生状况。2
37、、通过对细菌总数和大肠菌群数全过程的检验，使学生熟悉食品中微生物检验的程序；并用纸片法进行检测和对比。,【实验目的】,【实验原理】,对于一般的非罐藏食品，反映其卫生质量的微生物学指标主要有杂菌数、大肠菌群数和致病菌数三项。 杂菌数：指1g（1ml）食品中含有的细菌总数（平板计数法），它反映了食品被污染的程度和是否腐败变质的情况。 大肠菌群数：指100g（100ml）食品中的大肠菌群最近似数(MPN)，它反映了食品被粪便污染的情况，及是否有肠道致病菌潜在的可能性，而在食品中绝对不允许有致病菌的存在。不同的食品其微生物指标要求是不同的。 本实验只做杂菌数和大肠菌群数的检验。,【仪器与材料】,1样品
38、：虾丸、鱼丸、贝肉类，或学生自带样品等。2.营养琼脂，双料乳糖胆盐发酵管、单料乳糖胆盐发酵管，无菌三角瓶（含玻珠），无菌培养皿等。,【实验内容与步骤】,1.杂菌数的检验 采样稀释吸取1ml稀释样液于无菌培养皿中加入15ml、45培养基制平板旋匀静置凝固倒置培养（37，24h/水产类48h）观察计数,采样稀释乳糖发酵试验分离培养证实实验报告（MPN),2. 大肠菌群数的检验,实验报告,1 根据实验结果，计算所检样品的细菌总数。2 根据证实为大肠菌群的阳性管数，按MPN检索表报告所检样品的大肠菌群最近似数。3说明食品品质检测中，测定大肠菌群的卫生学意义。,【思考题】,1、为什么要测定细菌总数？2、
39、大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管进行初发酵？说明测定大肠菌群的卫生学意义？3、试设计一种食品的食品卫生状况检验方案。,设计性实验,实验二十水产品中腐败微生物的分离、纯化及鉴定实验二十一 红树林环境中抗菌微生物的筛选实验二十二 果酒的制备实验实验二十三 乳酸菌分离纯化以及酸奶的研制,实验要求,总体要求：1、四个人为一个实验小组，学生自己任选一个实验。2、实验小组根据查询的资料及每个实验的具体要求，设计实验方案并与指导老师讨论后确定最终方案后，方可进入实验阶段。3、实验的准备、实验操作及报告的完成均以学生实验小组自行完成，有问题及时找老师进行沟通。,实验11 水产品中腐败微生物的分离、纯
40、化及鉴定,分离材料：冷冻虾仁、贝类产品、虾丸、鱼丸。要求：1、根据不同产品的类型，分析可能出现腐败微生物的类型，并以此进行分离设计，同时对目标微生物鉴定项目也要进行设计；2、记录实验现象与数据，分析实验结果。,实验报告要求,1、阐述副溶血性弧菌的分离程序；2、记录实验现象与数据，分析实验结果；3、说明副溶血性弧菌在TCBS上的典型菌落特征。4、副溶血性弧菌的检验与一般微生物检验的样品 量比较；5、单料和双料氯化钠多黏菌素B肉汤的主要区别在哪里，有何用处？,实验12 红树林环境中抗菌微生物的筛选,分离材料：红树林土壤、红树林根、叶等不同部位。指示菌：白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。 要求：
41、1、查阅红树林生境的特殊性、共附生或内生菌为什么是研究的热点、红树林环境微生物研究的进展，主要有哪些类型微生物。2、选择一种分离材料如根、一种指示菌。3、确定一种或一种类型的微生物为分离目标，并以此设计选择性培养基。4、确定抗菌活性方法，对有活性菌株进行初步鉴定。5、对实验结果进行分析。,实验报告要求,1、统计共分离获的菌株数，其中细菌、真菌与放线菌所占比例？2、统计获得具有抗菌活性的菌株数，其中抗白色念球菌与抗金黄色葡萄球菌的菌株数各是多少？,实验13 果酒的制备实验,酿造材料：菠萝、红葡萄、苹果或其它。要求：1、查阅果酒的类型，根据已给定的酿造材料或自己提出的实验材料设计实验。2、酿造过程
42、中如何进行生产管理，管理的主要指标，如何进行监控，并要求有详细的记录。3、对异常现象出现的可能性要进行预测，并有解决方案。4、对最终产品有检测报告。,实验报告要求,1、要求记录发酵过程中温度、温度出现异常时采取的措施。2、记录发酵液的感官变化情况。3、最终产品的感官评价及酒精度的测定。,实验14 乳酸菌分离纯化以及酸奶的研制,分离材料：市售不同品牌的酸奶、泡菜。要求：1、要选择至少两种分离材料进行分离。2、对分离的菌株进行鉴定及产酸能力的测定。3、研制一种以上的酸奶制品，如果味酸奶、营养强化型等。4、对最终产品要有检测报告。,实验报告要求,1.设计从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌的程序和酸奶制作的工艺流程。2. 描述乳酸菌在改良MC牛乳琼脂培养基上的典型菌落特征。3.以发酵乳的组织状态、乳清析出状况、口感、风味和香味等感官评分的综合评价为指标，确定原料配比、接种量、发酵时间、发酵温度等最佳工艺条件。4.对自制酸奶进行理化检验（蛋白质、总糖、固形物、灰分、酸度、pH值）和微生物检验（活乳酸菌数，细菌总数，大肠菌群数，致病菌）。,
