1、HPLC 使用须知,刘扬中 实验室2009.09.12,内容简要,I HPLC仪器简介II HPLC 的使用及注意事项 HPLC 的保养与维护IV 错误实例,高效液相色谱 (High performance Liquid Chromatography) -仪器简介,易学难用,UV检测设备,色谱柱,进样阀,HPLC仪器简介,HPLC仪器简介,BCAD,HPLC仪器简介,Agilent 1100 手动进样器工作原理,HPLC仪器简介, HPLC 使用及注意事项,样品的准备流动相的准备开机前的准备进样前的准备实验步骤实验结束,基本原则： 避免由人为因素引起的系统或柱子损伤,源头： 样品流动相仪器操作
2、,实验目的：样品经过色谱柱达到分离分析的目的,一、 样品的准备,溶解样品的溶剂选择,与流动相 相溶 有机流动相： 尽量避免NaCl、磷酸缓冲盐，TEAA较好。如果不确定，可以先实验溶剂与流动相的相溶性。在固定相上可保留（针对进样体积较大时）离子交换柱：不用高盐溶剂反相柱：不用纯有机溶剂适当的pH 值,最好使用流动相溶解样品,一、 样品的准备,样品溶液除杂质,离心沉淀悬浮物（可能看不见） 10min 12K （注意：离心管会发热) 。如果有沉淀，将上清液转移到新的离心管中过滤（针对进样体积较大时）水溶液：0.22 m 滤膜过滤 （1、5、10ml注射器） 4久置的多肽和DNA样品；分离制备样品使
3、用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。,二、 流动相的准备,流动相选择,液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：,对样品具有一定的溶解能力，样品组分不会沉淀在柱中流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 流动相的黏度要尽量小流动相的物化性质要与使用的检测器相适应流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡在流动相配制好后，一定要进行脱气,流动相流速的选择：,内径 4.0mm，0.8ml/min内径 4.6mm， 1ml/min内径 10.0mm，5ml/min (半制备),二、 流动相的准备,流动相选择,使用高纯度试剂（色谱级
4、溶剂、高纯水、盐）反相柱，如C18柱（易吸附 极性小的物质）流动相：高极性低极性 如：A= H2O, B=CH3OH or CH3CN梯度应用： 90% A 10%B 100% B,反相柱-注意： 除非有说明，反相柱不能使用100% 水，否则会损坏固定相 !若A相含盐（NaCl, NaClO4）或为缓冲液(磷酸、醋酸)（10mM），B为有机相，则应开通C或D通道，为纯水以缓冲A B通道的直接接触,二、 流动相的准备,流动相选择,分离的样品在A、B中均可溶 !例如：沉淀的发生 DNA + TFACu2+、Ni2+ + 磷酸缓冲盐跨膜肽段 + 水分离效果 （参照文献，他人实验，自主摸索）,强阴离子
5、SAX交换柱（易阴离子物质）流动相：低浓度盐高浓度盐 （NaCl or 磷酸缓冲盐）如：A= 50mM NaCl, buffer , B= 2 M NaCl梯度应用： 100% A 100% B,强阴离子交换柱-注意：防止流动相，通道，柱子生长细菌，流动相应加 0.1-1 mM NaN3，操作时戴手套,二、 流动相的准备,流动相选择,更换流动相之前，必须事先阅读色谱柱的说明书 !（每根色谱柱均有独立的说明书和出厂报告：使用注意事项，恢复柱效，出厂压力等）注意色谱柱对流动相的要求 （pH值、有机溶剂）可用pH 值SAX柱 PN:880952-703： 2.0 7.0C18柱: Agilent Z
6、orbax SB-C18, 880975-902: 1.0 8.0Eclipse XDB-C18: 2.0 9.0Kromasil C18, PC-1025: 2.08.0,二、 流动相的准备,流动相处理,0.22 m 滤膜过滤，除去悬浮颗粒所有含盐、或含水溶剂，必须膜过滤 !100% 色谱纯有机试剂，最好过滤后使用 水膜(纤维素酯膜)：只含水和盐，不含任何有机相 有机膜：有机相，有机相和水的混合相 有机相能溶解纤维素酯膜刚刚从纯水仪接的水，可以不过滤直接使用过夜溶剂（保存在4），重新过滤后可以使用适当的例外 ：新近过滤的 100% 色谱纯有机试剂流动相现配现用，剩余的流动相(水相)及时清理，
7、试验间隔2天，建议倒掉任何溶剂，如果有可见悬浮物、菌丝，不可使用 !,二、 流动相的准备,流动相处理,除气，可提高分离效果（峰型）、延长仪器寿命。除气不好时，可能使再现性降低，甚至无法分离。在旧仪器上常见。脱气机的处理速度非常有限，无法除去大量气体（如气泡）过滤后，使用前，超声仪超声10-15 min,磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌的影响，不得放置过夜，应临用现制。 注意：用缓冲液后不能直接换用有机溶剂(实验过程),三、开机前的准备,流动相检查,泵的入口：有机溶剂在上(B,C 通道)，水相在下(A,D 通道)（避免盐沉淀）溶剂体积检查 与程序中体积一致。除去管路内的气泡。每次取出、放回
8、玻璃过滤头均需要检查!清理废液瓶,2. 计算机 IP 地址的检查,3. 关闭脱机程序,四、开机,开机注意事项,先开HPLC仪器开关，脱气机，泵和紫外检测电源等各电源开启后(30s), 打开在线软件在线程序上，先开启泵，暂不开紫外灯。走平衡时，打开紫外灯设置梯度和波长，或引用方法(注意检测的紫外波长)设置文件保存路径,具体的操作事项见HPLC开机操作步骤,四、开机,排气,- 除去管路内可能残留的气泡,旋开Purge阀 ，流速从1 ml/min升至到5 ml/min，压力应该 10 bar如果压力明显大于10 bar，可能是过滤白头堵塞，需要更换、或清洗。过滤白头通常可以使用3-6个月，如果过快，
9、可能是流动相不清洁。检查过滤过程的错误。逐个处理每个需要使用的流动相 3 5 min，5 ml/min注意：管路中如果看到气泡，不可使用泵排气! 必须事先手工排出气泡。,进样,平衡压力,洗柱压力,最大压力,五、实验步骤,注意压力的变化,五、实验步骤,样品分析,平衡柱子 10-15min,反相:90% A水相 ,10% B有机相阴离子交换:100% A 低盐相,进样针进样,扳下定量环进入设好的梯度程序(20-30 min)清洗柱子10 -15min(100% B),平衡柱子 10-15min.,注意压力的变化,五、实验步骤,数据分析,打开脱机程序,找到相应文件双击打开,查看保留时间,峰高,峰面积
10、 等简单的数据处理-截屏导出数据,文本形式,origin 作图,六、实验结束,清洗色谱柱、定量环 、进样针,C18 反相柱应保存于纯有机溶剂中，不含任何 酸、盐！洗净残余的酸(TFA)、缓冲盐 （用90% 纯水、10%有机溶剂，5柱体积）除去水（用100% 有机溶剂，如甲醇 5柱体积）离子交换柱旋开purge 阀,纯水清洗通道(A,D) 5ml/min 清洗5min.纯水洗去柱子的盐溶液, 5柱体积的水5柱体积纯有机相保存柱子,建议乙腈.,用数倍体积的甲醇冲洗定量环和进样针（或结合在下面步骤中）,进样针保存好,如果当天实验结束较晚、且次日早晨继续实验，清洗步骤可适当从简。(必须确保酸、盐不过夜
11、),六、实验结束,更换流动相,旋松Purge阀，流动相不经过色谱柱将四个过滤头均存放于有机溶剂瓶中，以防长菌先用纯水将含缓冲盐的管路洗净再用甲醇/乙腈将水排出, 充满柱子,如果当天实验结束较晚、且次日早晨继续实验，在确保安全的条件下（无腐蚀、不会长菌） ，此步骤可不做。,关闭程序和仪器电源,先把流速调为0, 压力将为0或1bar,再关闭软件程序(泵和紫外).依次关闭脱气机,泵和紫外检测器的电源, HPLC 的保养与维护,一 色谱柱二 进样阀三 通道和脱气机四 泵五 紫外检测设备六 其它,Eclipse XDB-C18, 5u, 4.6*150mmZorbax SB-C18 5u, 4.6*25
12、0mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mmZorbax SAX 5u, 4.6*250mm,一 色谱柱, HPLC 的保养与维护,实验室色谱柱统计：,Agilent 公司,PN:993967-902SN:USKH031706LN:B07016,PN:880975-902SN:USCL024985LN:B07051,PN:880952-703SN:USA0006475LN:ZBX0759005,PN:880952-703SN:USKH031706LN:B07016,Phenomenex公司,Kromasil 5u C18 10*250mm (半制备) 货号：PC-1025 柱号：80
13、9110Kromasil 5u C18 4.6*250mm 货号：PC-1025 柱号：06L25536 柱号： 90318,1、色谱柱的使用说明 储存液, PH值适用范围2、色谱柱的保存 3、色谱柱的再生 色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加,柱效下降4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法 ,柱压升高等,一 色谱柱, HPLC 的保养与维护,使用说明书和出厂报告:,一 色谱柱, HPLC 的保养与维护,故障症状,A. 色谱柱柱压,B. 色谱峰峰形,C. 保留时间,峰形问题多 是复合型问题,保留，色谱柱和分析结束时间都发生改变,解决办法详见:色谱柱维护,（1）色谱柱头的过滤筛板堵
14、塞或污染； 解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。 （2）色谱柱头的填料被样品污染； 解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。 （）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因P
15、H值使用不当，很难恢复 。,一 色谱柱, HPLC 的保养与维护,柱压升高部分常见原因及解决办法：,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动,更换色谱柱时，配件的使用,预柱,预柱套 预柱芯,预柱,Agilent 都有预柱，柱套 不变，更换柱芯，注意方向,预柱,1. 为了防止虹吸应注意使第五第六号放空管的出口与进样口保持在同一平面.2. 为了更好的重现性，进样体积最好是样品环的5-6倍。3. 一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平头针。一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈。4.转动阀芯时不能太慢，更不能停留在进样阀的中间位置5.常用密封垫的材质适用pH10,样品溶液p
16、H小于10； 否则换特氟隆材质的密封垫pH10-136. 进完样后一定要及时冲洗进样器，特别是用盐或缓冲液作流动相由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈。冲洗方法：A. 将进样器转至Inject位置，利用液相泵输送高纯水冲洗(这时是冲洗样品环及沟槽）.B.用阀清洗接头和注射器冲5. 经常用湿润的软布清洁进样器，特别是进样口周围,二 进样阀, HPLC 的保养与维护,注意事项:,二 进样阀, HPLC 的保养与维护,通常结合两方面：1 从进样器观察，进样后将针拔出，若从进样口或排空管有液体冒出，显示密封圈磨损。2 从结果看：通常有压力不稳定，峰面积或保留时间不稳定和残留严重。,如何判断手动进样器的密
17、封圈漏？,a) 扳到load的位置，进样时选择匀速慢推，进样量要大于定量环的两倍以上。 如果要进样量小于定量环，最好，进样体积小于定量环的一半。b) 进样后，迅速的将扳手扳到inject位置，2-3min 后把进样针取出，不要把针长时间留在进样器上，因为针在上面，针筒很重，针尖会受到比较大的力，针尖容易变形，时间长了，就会变形，也会影响进样的准确性。c)进样针，每次用了都要及时用溶剂清洗。避免溶液残留，堵塞塞针。最后要用甲醇清洗，以防生锈。d)手动进样器在扳动的时候，手旋转的时候，要寻找转动的轴心和进样的圆形一直，否则费力，而且容易把手动进样扳坏。,如何准确进样,三 通道和脱气机, HPLC
18、的保养与维护,溶剂过滤器堵塞或长菌1:1 HNO3 (35%) 浸泡1小时，超纯水洗净,建议不使用超声波清洗机清洗,定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次管路长菌的现象拧开脱气机出口或比例阀入口管线，并使液面高于出口30cm此时溶剂会因为重力流出，脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出。查看过滤器是否变色管道和瓶中是否有细微状物临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常原因：虽然将玻璃滤头放置在甲醇中，管路中仍然是含水溶液处理：旋开purge阀50水冲洗管道30min, 100% 异丙醇低速(0.5-0.8ml/min)冲洗管路数小时,甲醇或乙腈冲洗管路,污染的溶剂或溶剂瓶里的藻
19、类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵的运行。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7) 中尤其如此。下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。使用灭过菌的溶剂瓶来减缓藻类生长。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天。如果应用许可，在溶剂中加入0.00010.001 M的叠氮化钠。避免溶剂瓶暴露在直射阳光下。用氩气置换流动相上层的空气,三 通道和脱气机, HPLC 的保养与维护,防止堵塞溶剂过滤器, HPLC 的保养与维护,三 通道和脱气机,2)将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面(或较高处)。,四 泵, HPLC 的保养与维护,如何更好地使用四元泵,1),操作
20、泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30ml，对微脱气机10ml）冲洗真空脱气机,特别是当泵关闭了一段时间后（例如，过夜），以及在通道中使用挥发性混合溶剂时。,3),四 泵, HPLC 的保养与维护,五 紫外设备, HPLC 的保养与维护,灯：紫外区域采用有通光狭缝的氘灯作光源， 低压氘气体的等离子体能发出190nm到大约800 nm的光。可见光（VIS）和近红外光采用低噪音钨灯得到， 其发射出的光谱范围为470-950 nm,五 紫外设备, HPLC 的保养与维护,注意事项:,紫外灯不要频繁开启,灯关闭,2h 之后才可以再开. 有些过程不需要开紫外灯,如:更换色谱柱,脱气,实验结束时流动相保存
21、柱子的过程等.,紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）样品池要常清洗,日常操作条件,最好是恒温、恒湿 温度：15-30 相对湿度10bar,或换过滤白头后很快又堵塞原因：过滤时滤膜使用错误水溶液 水性滤膜 （）有机溶剂 有机膜 （）混合溶剂 有机膜 （）水溶液 有机滤膜 （ ）混合溶剂 水性膜（ 膜被溶解）处理：更换过滤白头，见更换视频。 换掉的过滤白头进一步清洗，超声等。,过滤白头堵塞,管路长菌,现象：原因：处理：, HPLC 的保养与维护三 通道和脱气机,见ppt,错误实例,排气不干净,现象：排气
22、时出液管中总是有气泡原因：更换溶剂瓶时大量空气进入、没有手工排气结果：可能需要连续排气1 - 2小时如果空气进入柱子非常可能损坏色谱柱处理：溶剂先超声10-15min。若系统引入大量空气需要异丙醇脱气，不经过柱子。,IV 错误实例,系统漏液,现象：仪器会自动检测到液体而自动停止试验原因：接口漏液，泵漏液，紫外等处漏液处理：停止试验，找出漏液端，进一步分析原因，采取相应措施，更换器件或维修,错误实例,泵的柱塞杆密封圈磨损,现象：泵端漏液，下方有积液，泵自动关闭原因：密封圈磨损后，导致有间隙存在。流动有颗粒存在或析出盐都会加速其磨损处理：更换密封垫。,IV 错误实例,错误实例,色谱柱堵塞,现象：压
23、力偏高,比正常情况下高几十bar处理：确定是色谱柱还是系统堵塞:断开系统与柱子的接口,1ml/min 流速, 压力在10bar 左右,说明不是系统引起;若压力明显很高,有可能是系统某部位堵塞.确定是色谱柱还是预柱堵塞,断开预柱与柱子的接口,1ml/min 流速, 压力在30bar 左右,说明不是预柱引起;若压力明显很高,很可能是预柱堵塞.确定是色谱柱堵塞,分析是什么原因引起.,IV 错误实例,错误实例,错误现象分析的一般流程,IV 错误实例,异常现象,分析原因,询问实验室人员咨询Agilent客服网上查询,维修处理,运行验证,继续试验,停止,试验,请 阅读 使用手册 !,如有不确定的问题，请及时咨询:（公司、手册、Agilent网站、他人、经验交流网站 ）,如有不确定的问题，请及时咨询:（公司、手册、Agilent网站、他人、经验交流网站 ）,常用网站,Agilent客服电话: 8008203278,Agilent Technologies: http:/ 出厂报告,附录,色谱柱 出厂报告,
