1、Waters 故障指南1目录1 色谱柱使用寿命 27 最理想的流速2 保留时间变化 28 键和的碳链3 保留时间漂移 29 pH 缓冲4 不同色谱柱和不同批次之间的重现性 30 流动相组分5 样品配制问题 31 柱子污染6 峰形拖尾原因 32 方法验证7 正相色谱 33 糖类分析中的双峰8 系统体积，死体积，滞后体积 34 方法控制9 梯度方法转移 35 流动相 pH10 系统堵塞 36 改善信噪比11 色谱柱塔板数 37 过载12 柱压 38 柱子的耐用性13 峰面积变化 39 快速分析和柱压14 鬼峰 40 反冲柱子15 pH 对保留时间的影响 41 选择性的改变16 柱平衡 42 新方法
2、17 柱改性 43 倒峰18 复杂的样品 44 麻烦，冗长乏味，费时19 疏水坍塌 45 快速分析20 基线噪音 46 LC/MS 的缓冲液21 小孔柱 47 反相色谱中的碱性缓冲液22 样品溶液 48 柱后衍生23 梯度比例 49 梯度滞留体积24 柱子保存 50 缓冲能力25 离子对色谱 51 流速的变化与定量关系26 反相填料的水解稳定性 52 极性物质的分析Waters 故障指南21 色谱柱使用寿命问：我的色谱柱进样大概 100 针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？答：100 针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的。首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。两种基本
3、情况：1 在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2 在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏如果是第一种情况，应该检查一下实验是否保持一致。样品的组成改变了吗？样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。 （色谱柱有没有掉到地上？）或者也有可能使生产商的问题。而且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。这种情况生产商会免费替换色谱柱。问：那些生产商真
4、好，但是我的情况不是这样的。我的色谱柱总是用不了多长时间。有时候 100 针，有时候 200 针。200 针还可以忍受，但是 100 针太差了。色谱柱开销太大了，我该怎么办？答：我完全同意你所说的。我们必须要找到原因然后看看我们能做些什么。最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质。随着进样的增加这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。从而导致峰形变差。通常这种问题和柱压升高同时出现。问：嗯，可能就是这个原因。我应该怎么避免这种问题呢？答：有几种方法可以采用。一，采用合适的样品准备技术处理样品。用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（S
5、PE：solid phase extraction） 1 效果很好。另外一种非常有效的方法是使用保护柱。保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。为了获得最好的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。如果用不同品牌的填料就不能获得最佳Waters 故障指南3的分析性能和保护作用。不要用大些的颗粒型号，大的颗粒或装填不好的预柱会因谱带扩展而导致分离效果变差。问：使用预柱听起来不错，还有其他方法吗？答：还有其他一些方法，但是他们都有缺陷。我不提倡用那些可能溶解色谱柱顶端污染物的溶剂去冲洗柱子。很多情况下，这个方法是没有作用的。例如，如果沉积在色谱柱顶端的污染物是蛋
6、白质，你冲洗的时候他们已经变性很久了，甚至可能交联在一起，变得难以溶解。此外，通常色谱柱是处于水解平衡状态，而每次冲洗都会除掉水解键合相。因此，重复的冲洗柱子会加速柱子的老化。而且，冲洗后还要用流动相平衡柱子，如果是做离子对色谱的话会消耗大量的时间。另一个经常用的方法是反冲柱子。如果用和流动相不同的溶剂冲洗会产生和上面相同的问题。如果用流动相的话，需要很长的时间才能除去污染物，也有可能根本就没作用。同时，反冲柱子会削弱柱子。尽管现在的装填技术可以使柱子承受反冲，但是一般情况下不要采取这种做法。问：那么最好的建议就是使用预柱了？答：绝对是。预柱也没那么贵-一般随品牌和型号的不同价格在 10$-5
7、0$之间，而他们所保护的柱子的价格是预柱的 10 倍左右啊。而且他们还可以避免其他来源的污染物的，这些污染物更加难以发现。这些来源包括比如流动相中的灰尘，泵脱落的密封圈的碎片，或者从流动相吸附的污染物等等。其中有些难以对付，而保护柱就可以阻挡这些。问：还有其他缩短柱子使用寿命的原因吗？答：有的，但是只要你按照生产商的说明使用柱子的话一般很少发生。有一个可能就是流动相 pH 超出使用范围而导致的柱子坍塌。样品用强酸或强碱溶解的话也会发生另外，一些特别的柱子有特别注意的地方例如氨基柱可以和醛，酮反应。氨基柱在不含缓冲盐的水溶液中会显强碱性，分解部分硅胶。Waters 故障指南4暴露在错误溶剂中的柱
8、子也会发生坍塌。因为这些柱子是基于非常松散的结构。他们是因颗粒之间的黏着而部分的结合在一起的。如果置于能破化这种黏着的流动相中，柱床很有可能会坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在 THF 中有时就会发生这种问题。这也是不要冲洗柱子的另一个理由。2 保留时间变化问：我的样品峰的保留时间不一致，什么原因？答：首先我们要知道是什么样的变化，这有助于我们找到问题潜在的原因。如果在连续进样过程中出峰时间不规则的变化，那么首先查看一下泵和溶剂混合装置。可以用量筒和秒表来测定流速，从而确认泵是否在工作。在其中一种溶剂中加入示踪剂，通过观察基线确定流动相的比例是否发生变化。如果流动相的比例不变，基线就是平稳的。如
9、果流动相的比例有变化，基线会发生相应的变化。比如你当你是使用紫外检测器的反相色谱法时，可以在有机溶剂中添加0.1%的丙酮，在 254nm 监测基线。另外，你也可以手动配制流动相而不用经过溶液混合装置。这样如果保留时间没有变化，那么问题就是在混合装置这里。问：连续进样过程中保留时间还是相当一致的，但是隔天进样的话就不一样了。答：这种情况的话不大可能使仪器的问题。最大可能是流动相组成的问题。在反相色谱中，保留因子 k 和流动相中有机相的比例是成指数关系的。通常，有机相变化 1%，保留时间会变化 5%-15%，一般是 10%。这就是说你要非常准确的配制溶液。最好是按重量而不是按体积来配制。另外，脱气
10、的方法也会导致保留时间变化。最好是真空超声 1min。这种方法溶剂蒸发的最少，效果很好。另外还可以采用氦气脱气法。在流动相和氦气达到最初的平衡后，应该降低氦气的流速。否则氦气会带走溶液的蒸气，从而改变溶液的比例。如果你的样品时离子型或者可以电离的化合物，控制流动相的 pH 就变得很重要了。pH 变化 0.1 会导致保留时间变化 10%。所以要准确的测量 pH，并且要校正好 pH 计。在反相色谱中随着 pH 的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长。顺便提一下，我的老师经常说：一个缓冲液之所以被称为缓冲液是应为他Waters 故障指南5对 pH 有缓冲作用。如果没有缓冲作用，就不是一个缓
11、冲液了。比如醋酸铵溶液就只是醋酸铵溶液，它不是缓冲液。一个醋酸盐缓冲液有醋酸离子和醋酸。如果两者在溶液中等量存在，溶液的 pH 就是就是该缓冲液的 pK 值，醋酸盐的pK 值是 4.75。缓冲液在 pK 值处有最大缓冲能力。问：我以前都不知道到控制流动相的组分和结果的重现性有这么密切的关系。还有其它需要注意的变化吗？答：另外一个重要的因素是温度。如果所有的峰的保留时间都朝同一个方向变动，可以推测是温度的影响。通常温度每变化 1保留时间变化 1%-2%。一般情况下影响没有那么大。但是有的地方在周末把取暖器或空调关掉了，发现在周末自动进样的结果和平常有差别。显然这种问题用柱温箱就可以避免。在反相色
12、谱中检测离子型或离子化的化合物时，保留时间会因缓冲液的离子化能力不同而变化。但是这种影响微乎其微，通常都可以忽略的。标准情况下缓冲液的摩尔数改变 20%保留时间会改变 1%。因为配制缓冲液经常是称量的，所以不大可能犯这么大的错误。问：有没有其他一些特别的情况需要考虑一些额外的参数？答：有的。在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子型化合物组分的保留时间。带有和离子对试剂相反电荷的分析物的保留时间会缩短，带同样电荷的会延长。中性化合物几乎不受影响。在低浓度情况下，比如 5mM/L，样品和离子对试剂相互作用（竞争吸附） ，保留时间随离子对试剂浓度的变化呈比例变化，在高浓度情况下，比如 10mM/
13、L 左右，吸附剂的表面的离子对试剂呈饱和状态，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物保留时间的改变。在开发方法的时候应该考虑到这点。如果想要你的方法对某一变量不敏感的话可以这样做。正相色谱的保留时间对流动相中的极性成分非常敏感。任何情况下水都是一个麻烦。不同数量的水导致不同的保留时间。有一个窍门是使用半饱和水的非极性溶剂比如正己烷和二氯甲烷来避免这个问题。使用方法是这样，取一定体积的溶剂，加入一些水，搅拌使水呈饱和状态，混合该水饱和溶剂和等体积的不含水的溶剂。该过程可使含水的非极性溶剂得到非常好的重现性。同样也可以防止保留时间的漂移，下面将详细介绍。Waters 故障指南63 保留时间漂移问：
14、我的色谱峰保留时间发生漂移，会是什么原因呢？答：这个问题很有意思。原因有很多，让我们一个一个来看。人们通常认为保留时间漂移是平衡的问题。如果你是做正像色谱用纯硅胶柱的话就很有可能是这个问题。正像色谱的保留时间对吸附在硅胶表面的水的含量是非常敏感的，所以流动相中溶有水的话，保留时间就会漂移。因为水在正己烷或二氯甲烷等溶剂中的溶解性非常低，所以柱子要很长时间才能平衡好。我曾碰到过一个例子，用非常纯的正己烷平衡一个星期后保留时间还是漂移。所以我建议避免使用非常纯的试剂。通常使硅胶达到水平衡的做法是使用半饱和水的试剂。制备方法是一体积的水饱和的疏水试剂：一体积的纯试剂混合。这个方法可以大大缩短平衡的时
15、间。在反相色谱中，通常很快就可以平衡的。只需要几个（5-10）柱体积的流动相就可以。当然并不是所有情况都这样。一个典型的例外就是含有离子对试剂的离子对色谱。离子对试剂的使用量一般是 2-5mmol/L 或更少。它们吸附在反相键和相表面，表面浓度在 0.5-2mol/m2。键和相的比表面积为 330m2/g，一根 4.6mm*250mm 的柱子含有 3g 的键和相，其表面积达到 1000m2。要 1L 的2mmol/L 的离子对试剂才能平衡好柱子。当然这只是极限的情况，不过一般用几百 mL 平衡柱子也不少见的。不要把用过离子对试剂的柱子换成有机相保存过夜，因为换溶剂的过程中离子对试剂被洗脱下来，
16、而再平衡又需要很长时间。问：这些现象都有一个共同点：流动相中含有低浓度的强吸收的物质。这就是导致保留时间漂移的普遍原因吗？答：是的。其他的没这么普遍。不过强吸收的物质也可能来自样品。这种情况下强吸收的物质会随着进样的增加而累积，从而导致色谱柱化学性质的改变。样品中赋形剂的吸收就是一个例子。通过观察保留时间改变的比率可以判断污染物是来自于流动相还是样品中。下面来做个实验：1 重复进样几次，如：重复进 4 次，每次运行 1 小时。2 不进样，泵入相同时间的流动相3 重复第一步4 将保留时间作图A：相对于时间Waters 故障指南7B：相对于进样次数如果第一张图谱呈平滑的曲线，就是流动相中携带有污染
17、物。如果第二张图呈平滑的曲线，样品就是污染物的来源。问：还有其他导致保留时间漂移的原因吗？答：有的。也有可能流动向组分随着时间而变化的。你如果不是使用现在带有在线混合能力的仪器的话，将会发现流动相的组分在慢慢的挥发。特别是在用氦气脱气的时候更加明显，所以应该将氦气的流速控制到最小。一个经常被低估的原因是键和相的水解。生产厂家通常规定一个 pH 范围，超过这个范围键和相救不稳定了。这个范围通常是 2-8 或 9。尽管如此，还是要小心对待这些极限条件的，分界线不是非常明显的。水解通常还取决于其他条件的，比如温度和有机溶剂，在这个 pH 范围之类也有缓慢的水解的。键和相在中等 pH 条件下是最稳定的
18、，pH3-5，低温。等度色谱条件优于梯度。当然水解确实也在等度中发生，键和相通常会自身吸附，处于一个自身平衡的状态。但是在梯度或清洗柱子的时候，使用到高浓度的有机溶剂时，自身平衡被打破，水解的键和相就被冲出了柱子。问：我会记住这些的。温度的改变会导致保留时间漂移吗？答：是的，温度也通常被考虑到的。如果你让仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保留时间随着实验室温度的改变而产生漂移。在许多地方，为了节能在晚上或周末室温会设置到不同的温度。按常理来说，室温每改变 1，保留时间改变 1%-2%。联系柱压的增加导致保留时间漂移的现象。柱压增加可能是因柱子污染物造成的，但是即使是过滤头堵塞都可能导致保留时间
19、的改变。压力会推动流动相通过过滤头，该过程中的摩擦会加热流动相。这种温度的增加就会导致保留时间的变化。另外还有一些导致保留时间漂移的原因，但是都非常少见。使用高覆盖率的键和 C18 末端完全封口的色谱柱在少于一定比例有机溶剂的流动相中因不能完全润湿会导致平衡很慢。这将会使流动相和固定相失去接触而导致“疏水坍塌” ，即固定相表面一些区域因键和相的自我吸收而导致与样品的交互作用减少。及时跑几个柱体积的有机溶剂就可以再生柱子了，最好是使用流动相中的有机修饰剂（？） 。这种现象在不是末端键和的色谱柱中很少或几乎没有碰到。Waters 故障指南84 不同色谱柱和不同批次之间的重现性问：我要开始开发一个新
20、的 HPLC 方法。验证之后，该方法将转道 QC 实验室并将使用许多年。我担心该方法的长期的重复性，特别是柱子的长期重复性。怎样才能确保好的重复性呢？答：首先，我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。如果可以预料到该方法将要使用好几年，在选择柱子方面就要做些功课。要想使柱子在该方法的可预见的适用期内可资使用，就要选择一些大的生产厂家。另外，要选择一种标准的表面化学物质-比如 C18 或 C8-而不是那些新奇的或很少使用的。换句话说，柱子的选择要保守点。下一个标准才是柱子的重复性，如果你或你的同事以前用一根柱子有很好的重复性，这是一个很好的起点。同时也要考虑生产商提供的信息。近来有的
21、厂家开始印刷他们的说明和不同批次的重复性实验的结果。你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。问:我该从这些信息中寻找什么呢？答：让我往后回一点，解释一下不同柱子和批次之间重复性的不同方面。下面，就说一下反相填料，因为他们更加普遍。如果你用同一批填料的不同柱子，将会得到不同的踏板数（峰宽） ，不同的柱压，不同的保留时间。保留时间与填料密度和柱体积呈比例改变，而柱体积则取决于柱子的内径。这个改变对你的方法应该是没什么影响的，因为所有峰的保留时间都呈比列的改变，而分离度还是没变。这个原因导致的保留时间变化的 RSD 通常在 3%左右，但是如果生产商对柱子的硬件有很好的控制，RSD 也可以低到 1%。柱
22、子踏板数的变化会影响方法，特别是做双峰的时候，它们很少能达到基线分离的。尽管 2-3%的踏板数的标准偏差已经可以达到，但通常还是在+/-10%，记住踏板数是个平方数，分离度仅仅取决于踏板数的根。所以踏板数2%的偏差相当于峰宽 1%的偏差。你要确认一下柱子的厂家是有踏板数的上下限，还是只有一个下限，上下限都有比较让人满意。同一装填程序的柱子其柱压的重复性是相当好的，同一批次变化应不超过+/-5%。问：那么批次之间的重复性怎么样呢？答：如果你注意一下批次间的色谱参数，你会发现同参数会不同，更重要的是Waters 故障指南9批次间分离的选择性也会改变。就是说峰的相对保留会改变，比如他们在色谱图中的相
23、对位置，这对你方法的确定性是不利的这种改变是你要尽量避免的，所以你要从厂家那里得到一些消息，他们是怎么确保批次之间重复性的，这包括一些物理，化学，色谱方面的测试。在物理测试中，最重要的一项是装填的表面积，该项参数的变化会直接导致保留时间的变化。所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。通常情况下幅度是+/-10%，但是+/-5%也是可以达到的。化学方面的参数最重要的是键合相的表面覆盖率。通常用多少 umol/m2 表示。许多厂家并没有直接给出这个参数，而只说明了 C 的百分含量。我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度，通常是+/-10%，低于+/-4%的也可以达到。最后你要
24、知道厂家的色谱重复性测试。通常色谱柱会附带一张色谱图，检测的是一些简单的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是这不是一个好的批次间重复性测试。因为这些中性疏水化合物的相对保留重复性相当好，对装填中表面覆盖率的改变是相当不敏感的。好的批次间重复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。在精心设计的测试中，精选的碱性化合物主要与残余硅羟基作用，而中性化合物则主要与键合相作用。只有含有 2 种化合物的重复性测试才是让人信服的。如果一个厂家是这样测试的并且有好的重复性，那么他的柱子会更加让人放心。问：我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系，我应该怎样在我的检测中确保一个好的批次间重复性呢？答：
25、你说的很对：上面的消息只能让你有一个比较大的机会确保重复性。但最后必须用你自己的检测来做重复性测试。有些厂家提供一整套的设备包括不同装填批次的柱子来做这个测试，另外有的厂家则按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的东西。同一装填批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键和反应装填的柱子。如果同一批次是不同天内装填，然后色谱柱编号又不同的时候的时候，厂家可能自己也会迷糊的。所以你最好询问 2 次，确保厂家给你的是你要的。你可能需要 3 根不同批次的色谱柱来为你的方法做重复性测试。如果批次间的改变不影响你的检测，那么接下来的时间你的方法应该有一个好的重复性。Waters 故障指南105 样品配
26、制问题问：我在样品配制过程中碰到一些问题。我是用反向吸附剂（reversd-phase sorbent）进行固相萃取的。通常回收率都有 80%或更多，但是有时候只有 50%或更低。问题出在哪呢？答：你的问题比较普遍。我发现回收率低通常是由处理方法造成的。80%的回收率对分析来说可能足够，但是对方法耐用性来说则不够。看来有一个原因导致样品不完全回收，损失 20%-50%。我们要找到损失的 20%-50%到哪里去了。问：ok，我们怎么找？答：有四个方案：1 分析物在固相萃取前丢失2 分析物在吸附过程中没有完全吸附3 一部分分析物在清洗过程中被洗掉4 部分分析物在洗脱过程中仍然留在固相萃取管中要确认
27、分析物是不是在吸附过程中穿过了 SPE 柱，我们只要在第一个 SPE柱后面再接一个 SPE 柱就好了。如果在第二个 SPE 柱的洗脱液中含有相当数量的分析物，那么就知道吸附是不完全的。有几个原因可能导致不完全吸附。1 样品的浓度太高，如果这样要用水稀释样品（可电离的样品用缓冲液稀释） 。2 确认 SPE 柱是否活化了。反相固相萃取管的活化先走有机相（甲醇，乙腈等）再用水或缓冲液平衡。然后样品才能吸附上去。很多人想省掉这些额外的麻烦步骤，但是为了保证方法的准确性这是必须的。问：我已经按照厂家的建议活化管子了，所以应该不是这个问题。我喜欢你的加一个管子来核实吸附过程的完整性的建议。我应该怎么检查方法的其他步骤呢？答：检查清洗过程，你要收集所有的清洗液，然后用 HPLC 分析。但是如果清洗过程中有干扰分析物的物质也被洗脱下来，那么就不好对清洗液中的分析物进行定量分析。这时我们可以通过下面的技术手段来解决这个问题。把清洗液蒸干，用样品的配制溶液溶解，再用同样的方法萃取一遍，如果在这个洗脱液中能检测到另一比例的分析物，那就知道了在清洗步骤中有一部分的分析物被洗
