1、发酵工艺学发酵工艺概论 发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料，生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学，化学工程，基因工程，细胞工程，机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料，醋酸和面包，而且生产各种食品添加剂：谷氨酸， 柠檬酸，苹果酸，核苷酸，多糖等；医疗保健药物如胰岛素，干扰素，生长激素，抗生素和疫苗；农用生产资料：天然杀虫剂，细菌肥料，微生物除草剂；在化学工业上生产 AA，酶，维生素和单细胞蛋白等。 Use of microorganisms： 适应性强 消化能力强 繁殖能力强 1857 年，法国化学家，微生物
2、学家巴斯德提出了著名的发酵理论“ 一切发酵工程都是微生物作用的结果” 。巴斯德认为：酿酒是发酵，是微生物在起作用。酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。可用加热的方法来杀死有害微生物，也可将纯种微生物分离出， 获得所需发酵产品。 一、发酵工程（fermentation engineering）1直接利用微生物的机能将物料加工以提供产品的过程，又称微生物工程。 在最适发酵条件下，大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。2发酵工业简介 Fermentation Industry发酵食品 Fermented Foods有机酸 Organic Acids氨基酸 Amino Acids核酸类物质 Nucl
3、eotides酶制剂 Enzymes医药工业（抗生素） Pharmaceutical (Antibiotics)饲料工业（单细胞蛋白) Feedstuff (eg. SCP)环境工程（废物处理） Environmental Application (Waste Treatment)其它 （冶金工业） Others (eg. Metallurgical industry)二、微生物（一）为什么要利用微生物？微生物繁殖非常迅速微生物培养易于控制微生物本身也容易改造（二）抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为什么能通过微生物发酵来生产？这与微生物的生长和代谢特点有什么关系？1、某些微生物因争夺生存环境或营养
4、物，会 产生抗生素将其他种类的微生物杀死。2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营 养物质水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖 。3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。三、Fermentation engineering1发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程上游工程 FERMENTATION Process Control 下游工程UPSTREAM PROCESSES DOWNSTREAM PROCESSES- genetics, cell - product extraction, purification&
5、assay- inoculum development - waste treatment -media formulation -by product recovery-sterilization- inoculation2获得发酵产品的条件适宜的微生物保证或控制微生物进行代谢的各种条件进行微生物发酵的设备精制成产品的方法和设备Use of Microorganisms：Positive（益处）-Biomass-Production-ConversionNegative（危害）-Pathogens-Spoilage3发酵的定义传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象
6、，或者是指酒的生产过程。Fermentation 最初来自拉丁 语“发泡”（fervere）生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出 CO2。或更严格地说：发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。工业上的发酵：泛指利用微生物生产某些产品的过程。产品有细胞代谢产物，菌体细胞， 酶等。包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。四、发酵工业简史1.天然发酵阶段：sauce, pickled vegetables, cheese, dough
7、 fermentation2.纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。3.通气搅拌技术的建立：青霉素的生产 深层培养。4.代谢控制发酵：Glu 和 Lys 生产。5.开拓原料时期：石油发酵，醋酸生产谷氨酸6.基因工程阶段：将不同来源的 DNA 进行体外重组， 转入受体细胞进行繁殖和遗传，达到定向改变生物性状的目的。时间 发酵阶段 主要产品 主要技术-1900 天然发酵 酒 醋 干酪 酵母 天然分批1905- 纯培养 酒精 丙酮丁醇 密闭纯培养1940- 通气搅拌 抗生素 有机酸 通气搅拌酶 维生素 分批或连续1957- 代谢控制 氨基酸 核苷酸 选育缺陷菌株1960- 开
8、拓原料 单细胞蛋白 连续发酵1979- 基因工程菌 胰岛素 干扰素 DNA 重 组纯培养:第一个转折点 通气搅拌:第二个转折点 代谢控制：第三个转折点 基因工程菌：第四个转折点 History of applied microbiologyAncient times-flavour (bread, soy sauce)-brewing (beer, wine) 1861 Louis Pasteur-first phase industrial biotechnology1940 penicillin (Fleming)-antibiotic industry-production of fin
9、e chemicals原始发展阶段（发酵技术开始于家庭小制作，技术进步缓慢，完全是经验式的，并不知道其中的原理。） 传统发酵工业阶段（人们开始了解发酵现象的本质，采用开放式的发酵方式，生产过程及设备较为简单，规模一般不大。）现代发酵工业阶段（技术要求高、发展速度快；生产规模大；菌种生产能力大幅度提高，新产品、新技术、新设备的应用达到前所未有的程度。）生物技术产业阶段 （利用构建的基因工程菌生产。）五、生物反应的过程：实质是利用生物催化剂从事生物技术产品的生产过程。Cell enzyme biocatalyst monitor sterlized air productbioreactor ex
10、tract by product residuesterilizingmedium空气 保藏菌种 碳源、氮源、无机盐等营养物质 空气净化处理 斜面活化扩大培养种子罐 灭菌主发酵产物分离纯化成品菌种筛选 选摇瓶试验 发酵罐试验发酵工程的概念和内容菌种选育：自然界筛选、诱变育种、基因工程、细胞工程培养基配制：根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方 灭菌：杀灭杂菌扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）：检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等分离纯化：菌体：过滤、沉淀 代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换四部分组成1菌种选育及扩大培养：生物催化剂的制备， 筛选到高产， 稳产，培养基要求
11、不太苛刻的菌种。2原料预处理及培养基的制备：淀粉制糖，糖蜜原料3发酵设备及反应条件的选择：生物催化剂是酶：酶反应过程生物催化剂是生物细胞：发酵过程两种发酵方式（根据对氧的需要分）：厌氧alcohol, beer, acetone, butanol, lactic acid, amino acid好氧需大量的氧，通入无菌空气。氨基酸，抗生素（antibiotic）根据培养基物理性状分：固体和液体根据微生物生长特性分：分批和连续 4产品的分离与纯化：是从发酵液中提取符合质量指标的制品。即根据产品类型，特点 选择合适的下游技术（downstream processing）的组合。六、微生物工业产品的
12、类型1微生物菌体的发酵以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵工业。传统的菌体发酵工业：面包酵母发酵 微生物菌体蛋白（ 单细胞蛋白）现代的菌体发酵工业：药用真菌（如冬虫夏草，灵芝与天麻共生的密环菌）农业上生防治剂：苏云金杆菌（t）,蜡状芽孢杆菌，细胞中的伴孢晶体可以杀灭 鳞翅目和双翅目害虫；丝状真菌的白僵菌，绿僵菌可以防治松毛虫；木霉菌可以防治生物病害。另外，活性乳酸菌制剂，用以改善人体肠道微环境，也是一种菌体的直接利用。还有人畜防治疾病用的疫苗等。 2. 微生物酶发酵酶普遍存在于动物，植物和微生物中。酶的最初来源是从 动植物组织中提取。但目前应用的酶大多来自微生物发酵。如在食品工业中，用微生物生
13、产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分氨基酸。目前应用的酶大多来自微生物发酵。3. 微生物代谢产物发酵：以微生物代谢产物作为产品是发酵工业中种类最多，也是最重要的部分。这类产品可分为两类：(1)初级代谢产 物(primary metabolite)菌体生长繁殖所必需的，在对数生长期产生的物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质等。许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性。(2)次级代谢产 物(secondary metabolite)与菌体生长繁殖无明显关系，是在菌体生长的稳定期（静止期）合成的具有特定功能的产物。如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子、色素等。也把初级代谢物的非生物量的
14、积累看成是次级代谢物。如微生物发酵产生的维生素，柠檬酸，谷氨酸。初级代谢产物和次级代谢产物的异同： 4. 微生物的生物转化利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有价值的产物。最古老的生物转化：利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。另外还有：异丙醇丙醇 葡萄糖葡萄糖酸 山梨醇山梨糖 最显著的特点是特异性强，包括反应特异性， 结构位置特异性和立体特异性。由微生物 细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应。5. 微生物特殊机能的利用利用微生物消除环境污 染保持生态平衡等湿法冶金（金属的浸沥 回收）利用基因工程菌株开拓发酵工业新领域第一章 菌种选育第一节 工业常用微生物及要求一
15、、常见微生物（一） 细菌（bacteria）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）芽孢杆菌属（Bacillus）:-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最 为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium ）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces ） 属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。链霉菌（Streptomyces）：红，金，土， 氯， 链霉
16、素小单孢菌属（Micromonospora ）：庆大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1. 曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A. niger）产蛋白 酶，淀粉酶，果酸酶， 变异菌株产柠檬酸米曲霉（A. oryzae）产 淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和 酱油曲黄曲霉（A. flavus ）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。2. 青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点桔青霉（P. citrinum）：产生 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。3. 根霉属（Rhizopus ）接合
17、菌 米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis）酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。4. 红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）假丝酵母属（ Candida）产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。毕赤酵母属（ Pichia）产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。（五）其它微生
18、物1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们 的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。 从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28 倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的 2035倍。（六）噬菌体（phage）凡用细 菌和放线菌为生长菌株的 发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是：体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。没有细胞结 构，由核酸的蛋白质构成。营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体引起寄主细胞迅速裂解。受感
19、染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。噬菌体危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。二、微生物工业对菌种的要求1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.易控制培养条件，发酵周期较短。3.抗杂菌和噬菌体的能力强。4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不 产生任何有害的生物活性物质和毒素，保 证安全生产。第二节 工业微生物菌种的选育在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统， 趋向于快速生长和繁殖。但 发酵工业需要培养微生物使其积累大量的代谢产物。所以要采取种种措施打破菌的正常代谢，积累所需要的代谢产物。如青霉素的原始菌种产黄色素， 经菌种选育，
20、可使 产生菌不再分泌黄色素。土霉素产生菌产生大量泡沫，经诱变处理改变遗传特性可使泡沫减少， 节省大量消泡剂。菌种经诱变获得抗 phage 的特性。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。一、自然选育：从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种从自然界分离获得菌种1. 采样：取地面 515 cm 的土壤。2. 增殖培养：(富集培养 enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。方法：（1）控制培养基的营养成分：如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。（2）控制培养条件：细菌，放线菌：pH7.07.5 3537霉菌，酵母菌：pH 4.56.0 2028（3）抑制不需要的菌类分离细菌：加入丙酸钠以抑制霉菌，酵母分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧3. 纯种分离（1）划线法：简单、快速。 （2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，适合分离具有蔓延性的微生物。 固体培养基四区划法接种法步骤一接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤二
