1、大鲵饵藻的室内培养 金立成、 胡传林微藻,特别是单细胞微藻的营养丰富,含有大鲵生长发育所必需的营养物质.自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用微藻这一资源解决人类食物和动物饵料的缺乏问题.另一方面,微藻可直接或间接的作为水生动物的饵料,因此,微藻培养对大鲵繁殖具有更大意义.关于微藻培养,还有其它意义,从一些微藻提取药物;或研究微藻生理,以及用于太空食品等.在水生动物利用方面,微藻培养主要是解决大鲵饵料.今后,随着繁殖事业的发展,对一些新品种的繁殖以及解决某些品种幼鱼的饵料,必然涉及到微藻的培养.因此,有必要了解微藻培养的基础知识.先仅就拟球微藻一般培养方法及有关理论加以简述. 一.拟球微藻 N
2、annochLoropsis ocuLata金微藻门 ChrysoPHycoPHyta真眼点微藻纲 EustigmatoPHyceae真眼点微藻目 EustigmataLes单珠微藻科 Monodopsidaceae1.生物特性拟球微藻之细胞为小球体，直径 24 微米，无鞭毛，无眼点，外观与绿球微藻极相似，故称之为拟球微藻。唯细胞较小，微藻色稍黄（培养老化时更明显） ，分裂时产生两 ind 子细胞（绿球微藻产生四 ind） 。此微藻在 1986 年始经日本筑波大学千原光雄等定名为 （annochLoropsis ocuLata（Maruyama et aL., 1986） ，在此之前在日本称之
3、为海产绿球微藻（marine ChLoreLLa） 。拟球微藻属真眼点微藻纲，含有叶绿素 a 及类胡萝卜素vioLaxanthin 及 vaucheriaxanthin ester，而绿球微藻属绿藻纲则含有叶绿素 a、b 及类胡萝卜素 Lutein。拟球微藻主要发生于温带水域。最近之研究（GLadu, et aL., 1995）亦指出名为 ChLoreLLa minutissima UTEX 2341 Fott et Novakova 之微藻株，含有其它ChLoreLLa 微藻株没有的 steroLs，如choLesteroL、isofucosteroL、24ethyLenechoLester
4、oL 及 fucosteroL 及，并含有20：5n3、chLoroPHyLL a 及 vioLaxanthin，不含 chLoroPHyLLs b 或 c；应亦属真眼点微藻纲之 NannochLoropsis sp。其在生长停滞期的细胞有相当比例具有细胞外构造，离心会移去或瓦解该构造。 NannochLoropsis 属细胞内之色素成份 chLoroPHyLL a：b：c：p（carotenoid）之比值为 1：0.000.03：0.010.03：0.040.54，但ChLoreLLa 属则为 1：0.34：0.02：0.35。因此某些分类上名为 ChLoreLLa 属者，其真正类别待验证。
5、 真眼点微藻纲亦包含原属绿藻纲之 NannochLoris ocuLata 及原属黄微藻纲（Xanthohyceae）之 MonaLLantus saLina 。绿藻纲含 ChLoroPHyLLab 及类胡萝卜素Lutein，黄微藻纲含 chLoroPHyLLac 及类胡萝卜素 didinoxanthindiatoxanthin，真眼点微藻纲含 ChLoroPHyLL a 及类胡萝卜素 vioLaxanthinvaucheriaxanthin ester。其中 N. ocuLata 具有 urease（尿素分解酵素） ，细胞二分裂，不产生动孢子。 ELLipsoidon与 MonaLLantu
6、s 为同属异名（BourreLLy 1968，cited in Antia et aL.,1975） ，故 E. acuminatum 亦为真眼点微藻纲之一成员（Hibberd and LeedaLe，1972，cited in Antia et aL.,1975） 。 2.培养方法（1）温度、盐度、光照度及 PH 值：拟球微藻在 1035温度范围内均能增殖，而以2531间之增殖率最高，在 37之水温环境中 24 小时仍能活存，且于降温后仍能增殖。对盐度之适应范围甚广，在 577ppt 范围内均能增殖，而以 2035 盐度之增殖最好。喜欢强光照，增殖率随照度增加而增加，至 12,000 Lux
7、 时增殖率达最高，且维持不变至30,000 Lux 仍可维持最高增殖率。培养液最初的 PH 值与增殖率间之关系呈抛物线，以pH7.58.8 之增殖最好。 日本屋岛试验场于 1963 年在 1t 水槽中施肥，培养采自屋岛湾之硅藻，起初硅藻滋生繁茂，不久即渐减，且水色由褐转绿，终于变成以海产绿球微藻为优势种。于是接入桡足类饲养，但不久桡足类即渐死亡，仅剩微藻仍继续增殖。而后虽弃之不管，但随着微藻色渐淡，却伴生许多白色小点的壶形轮虫。得此启示，研究人员乃开始以拟球微藻培养轮虫，并以轮虫投喂鲵苗，展开海产鱼介类种苗生产的新页。拟球微藻含有丰富的二十碳五烯酸（EPA） ，故颇适于壶形轮虫的培养与营养强化
8、，以及种苗培育池之水色维持。图 121 存储时间对拟球藻培养的影响（2）肥料：拟球藻最初于日本屋岛试验场培养时，所用之肥料为硫酸铵 50g/t、过磷酸钙 15g/t、帝国化学制造之 CLewat-32（微量金属混合物）5g/t。目前，日本各栽培渔业中心之使用量为：硫酸铵 50100g/t、尿素 1060g/t、过磷酸钙 1530g/t、CLewat-32 05g/t。依据笔者试验结果，使用单一氮肥时尿素效果最好，不过混合等浓度硫酸铵及尿素之肥效比单一氮肥更好，因此，目前使用硫酸铵 66g/t、尿素 30g/t、过磷酸钙 30g/t。一般于培养之始以全部水量来计算基肥使用量，且于再添新水时再施肥
9、，施肥量以所加水量计算。 3.培养流程：(1）.清洗水槽，使用有效氯 10左右之工业用漂白水消毒水槽、打气管及打气石。漂白水使用量为 20g/m3有效氯，亦即 1t 水加 100200 mg 工业漂白水。 (2）.培养槽注入淡水，接着加入 10g/m3有效氯之漂白水，静置隔夜后，再加入10g/m3 ,（10g/t）硫代硫酸钠（海波）中和残余氯，然后接种良好拟球藻种，拟球藻种与新注入淡水的比例为 1/11/5，视种源质量、淡水水质及气候而定。另外，可使用淡水及自来水（藉水中余氯来消毒）调成盐度 1520 之培养用水。 (3）.施肥打气培养至水色不再变浓时（约 47 天） ，收获 1/3 水量之拟
10、球藻水，供作轮虫培养或其它水槽接种用种源，而后原水槽再加入新淡水，并添加肥料，如此重复进行至拟球藻细胞增殖不良时全部收获；或采回分式培养，当水色不再变浓时，一次全部收获。(4）.如需再培养则从流程(1）开始。 4.问题点与改善方法：(1）.轮虫感染：注意拟球藻池与轮虫池之分开，使用器具需加以隔离，工作人员须谨慎操作，感染之拟球藻池必须以漂白水浸泡消毒后再使用。 (2）.原生动物感染特别在高水温期易发生，因此，各项设备及用水需使用漂白水加以消毒，以减缓感染。最好的预防方法是利用拟球藻种优势抑制原生动物的感染，亦即收获量或加新水量需少于总水量的 1/2，而每间隔 35 天收获一次。 (3）. 拟球
11、藻感染：选择优良种源，并采拟球藻种优势培养，可有效抑制其它拟球藻感染。 (4）. 拟球藻色变化之控制：注意水质及天气变化，适时注水降温、降 PH 值，移殖或收获。 (5）.搅拌及光照之控制：由于细胞不会游动，若打气不足，培养较长时，底部会有沉淀层，因此需每日大搅拌一次将池底扬起。拟球拟球藻喜强光，拟球藻浓度高时，由于细胞相互遮蔽，会降低光照强度，故需降低水位以增加照度，有覆盖时，水深以 3040cm 为宜，露天时不超过 100cm，冬天水位宜低，夏天可加深。 第二节舟形藻的培养一.舟形藻(NavicuLd tenera Kutzing)舟形藻(NavicuLd tenera Kutzing)
12、是大鲵自然繁殖的基础和关健营养物质。近三十年来大鲵人工繁殖存在的问是亲鲵性成熟率极低，精卵质量差。其原因是迁地后的驯养过程中缺乏大鲵原来的生物链，也就是缺乏天然水域的硅藻的蛋白质与脂肪酸。大鲵性成熟不仅需要生态环境优良，还取决于营养物质的水平与质量，特别是蛋白质与脂肪酸的水平及质量。而脂肪酸又取于高度不饱和脂肪酸。因大鲵长期生存于特定的溪流中，所以该溪流中适宜大鲵生长与发育所需舟形藻中天然蛋白质与高度不饱和脂肪酸是关键的营养物质。硅藻图 12-2 所示。 （适宜大鲵生长发育所需的硅藻）舟形微藻针杆藻异极藻卵形藻桥弯藻羽纹藻1.舟形藻的培养， (1).采样 分离舟形藻种，必须从大鲵原产地天然水域
13、中分离。 采样及预备培养个体较大的底栖舟形藻（30微米以上） ，可用350目的底栖生物网在水中捞取。通过底栖生物网的过滤，可获得较浓的舟形藻样品。把水样采回室内处理。 (2).预备培养 水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的舟形藻，而这种舟形藻在水样中数量较多时，可立即进行分离。若数量很少，分离困难时，最好先进行预备培养，待其数量增多时，再分离。 预培养的培养液营养盐的浓度应小些，一般只有原配方的1/4-1/2。预备培养的培养液最好能使所需舟形藻良好生长，而不需要舟形藻的生长受到限制。可有选择地加入药品。例如：在培养液在加入抗菌素可抑制硅藻生长，用量为1-10mg/L。抗菌素可选用青
14、霉素或硫酸链霉素。 2.舟形藻种分离方法， （1）微吸管分离法 ：在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时, 用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的舟形藻细胞, 放松手指 , 舟形藻细胞被吸入微吸管 ;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上, 显微镜检查水滴中是否只吸到舟形藻细胞,经过如此再反复操作, 直至达到单种分离的目的。然后把分离出的舟形藻细胞冲入预先装有培养液的试管内, 放在适宜的光照下培养,试管有舟形藻色后镜检,培养为单种的试管,其它不合格的弃掉。(2).稀释分离法 ：将待分离的舟形藻藻种，用300目过滤原产地溪河淡水充分漂
15、洗，将含有硅藻的溪流水在低倍镜下用毛细微吸管分拣，选出所需的舟形藻藻种，置24孔细胞培养板之首孔中，加入约6mg的舟形藻培养液并吹打,然后从中吸取3mg于第二孔中,另加3mg培养液再吹打,重复操作至二十四孔。接种完毕后将细胞培养板放在光照培养箱中培养,每日定时镜检,及时添加培养液,防止藻液干涸。培养箱温度为22,光照为2500Lx,培养3-5天后,在低倍镜下再次分拣出所需舟形藻种,静置培养。以本次分离培养藻为母液,重复操作3-5次并经青霉素-链霉素混合液处理后,即可得无菌纯藻种用于扩大培养。(3).平板划线分离法：仅适合于能在固体培养基上生长的种类。 取1mg藻液放入洁净的离心管中,加入无菌培
16、养液5-6mg,摇匀,然后再离心,反复操作上述步三次后再加入无菌培养液5-6mg稀释,用一支无菌的滴管将其吹打均匀。把接种环在无菌操作的要求在舟形藻液中取出一环,轻轻在培养基平面上做第一次划线34条,把培养皿转动约70角,并把接种环在酒精灯上灭菌,通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。由于第一次划线接种环上的舟形藻细胞比较多,在第一区划舟形藻细胞可能密集不能分离开,但通过后面的划线可能分离出单独的舟形藻。每天生产 1000Kg 舟形藻水需要的容器，有 1 升三角瓶 16 支、12 升透明塑胶圆桶 16个（置于室内木架）及 500 升原色 FRP 水槽 8 个（室外）。其
17、保种及大量培养流程如图12-2。当作种原之藻以培养 4 天的为最适宜，在不同规模容器之藻细胞浓度，1 升的为 300 x 104cels/mg，10 L 的为 600 x 104cels/mg，500 L 的为 250 x 104cels/mg。接种的量以培养水和种原量比来表示，1 升的 三角瓶的接种比例为 800mg：200mg，12 升的塑胶圆桶为 10 升：0.8 升，500 升的 FRP 水槽为 400 升: 200 升 。培养水的处理方法，1 升的三角瓶采用高温高压灭菌，12 升的及 500 升的各添加二氧化氯（氯含量以 50%计算）1mg 及 50mg 来灭菌，二氧化氯水添加后 1
18、2 小时或隔夜，再加入 10g/ m3硫代硫酸钠，将残氯中和后，即可接入藻种。操作流程如图 1221 千克灭菌淡水接种加 1mgWa 升 ne 培养液采收 1000mg200mg 800mg保种室内 100mg二氧氯水灭菌100mgWa 升 ne培养液10mg 采收灭菌淡水培养34 天10 升+10mgWa 升 ne 培养液培养 34 天34 天34 天采收使用培养舟形藻加入鱼苗池做水室内室外 500 升漂白水灭菌尿素30g/t 过磷酸钙 30g/t氯化铁 2.7g/t 硅酸钠 60/t20mg图 122 舟形藻培养操作流程1 L 的三角瓶及 12 L 的塑胶圆桶之培养配方硝酸钾 600mg/
19、L、磷酸二氢钠 60mg/L、三氯化铁 12mg/L、硅酸钠 700mg/L，500 L 的 FRP 水槽之培养则添加一般农业用无机肥料，其使用量为尿素 30g/T，过磷酸钙 30g/T，氯化铁 2.7g/T、硅酸钠 30g/T。营养盐只有在加新培养用水时才添加。在开始仅有 1 升培养作为种原，到每天生产一 t 藻水之培养配备暨保种及培养操作日程如表 12-1。第 1 天至第 4 天每天各接种 4 个/ L；第 5 天至第 8 天除继续每天以收获的 200mg 接种 1 升外，以收获的 800mg 接种 10 升；第 9 天至第 12 天再继续每天以收获的 200mg 接种 1 升、800mg
20、 接种 10 升外，收获的 2 个 10 升接种 1 个 1500升 ；第 13 天起除继续接种 1 升 、10 升 及 500 升外，每天可使用 800 升舟形藻水。如此根据舟形藻水需要量，如 1000Kg、2000Kg，以此类推，规划培养设备及操作策略。表 12-1 舟形藻从 1 升种原开始培养到每天生产 1000Kg 藻水之培养配备及保种、培养操作日程天数 1L 培养 12L 培养 500L 培养 每日可使用量第一天 接种 4ind 第二天 接种 4ind 第三天 接种 4ind 第四天 接种 4ind 第五天 收获 4ind、清洗再接种4ind接种 4ind 第六天 收获 4ind、清
21、洗再接种4ind接种 4ind 第七天 收获 4ind、清洗再接种4ind接种 4ind 第八天 收获 4ind、清洗再接种4ind接种 4ind 第九天 收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind接种 2ind 第十天 收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind接种 2ind 第十一天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind接种 2ind 第十二天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind接种 2ind 第十三天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind收获 2
22、ind、清洗再接种2ind800 公 L第十四天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind收获 2ind、清洗再接种2ind800 公 L第十五天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind收获 2ind、清洗再接种2ind800 公 L第十六天收获 4ind、清洗再接种4ind收获 4ind、清洗再接种4ind收获 2ind、清洗再接种 800 公 L2ind3.水处理：舟形藻生产用淡水之处理与配送之流程如图 123.4 所示，因饵料生物种类及培养水量之不同而异。水的理化要求见表 122表 122 大鲵原产地溪流水理化元素值淡水 抽水井 淡水水塔 输送管路曝气池抽水 沉淀池砂滤桶屋顶蓄水池室内 室外图 12-3 淡水配送流程
