1、目的基因(珠蛋白基因)片段克隆以及阳性克隆的筛选 菌落PCR,邱逸敏基因工程与发酵工程教研室,DNA克隆的过程,获得目的DNA片断 (提取质粒DNA、PCR、酶切)载体DNA与目的基因连接转化受体细胞筛选转化子表达目的基因,连接反应后,可形成多种类型的DNA分子1.不带外源DNA的载体自连分子2.外源DNA彼此相连的多聚DNA分子3.载体与外源DNA相连的分子通过筛选鉴定: 1.有没有外源DNA 2.外源DNA的连接方式是否正确,重组子筛选方法,遗传检测法物理检测法菌落原位杂交法免疫化学检测法测序菌落PCR,遗传检测法 (1)抗药性记号插入失活选择法,(2) -半乳糖苷酶显色法筛选重组子-互补
2、作用,利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中,该位点如果没有插入外源目的基因,lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶,如果平板培养基中含有IPTG(乳糖操纵子的诱导物)和X-gal,X-gal( 半乳糖苷酶的底物)便会被半乳糖苷酶水解成兰色,大肠杆菌形成蓝色克隆 在多克隆位点插入外源目的基因,破坏了lacZ基因的结构,大肠杆菌形成白色的克隆,菌落原位杂交,免疫化学检测法,对所有的转化细胞进行培养,把一张硝酸纤维膜均匀地压在含有许多单个菌落的培养皿表面,用碱处理膜,使细胞裂解,表达产物蛋白质将释放出来,加入带放射性的某一特定基因编码的蛋白质的抗体可与表达
3、产物蛋白质结合,自显影即可检出。,提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐; 蓝白斑筛选法需要载体有特殊的结构; 杂交筛选法除操作比较复杂外,尚需使用同位素;插入失活法仅适用于个别载体。本次实验中抗性平板上生长菌落数量众多,采用一种快速、简便的筛选方法菌落PCR,菌落PCR :是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增,用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。,操作步骤,在PCR管中加入PCR pre-Mix(已配好)为平板上将要挑取
4、的菌落标上号码(每组挑取8个菌落),用无菌牙签挑选单菌落,将菌落转至PCR管中(牙签在pre-mix中洗一下)用无菌牙签挑选单菌落,将菌落转至试管中(牙签在LB液体中洗一下),220rpm/mim过夜。设定PCR程序,开始PCR。电泳检测。,菌落PCR体系:20 ul 预混 9份2PCR pre-mix:10 ul 90ul (with Mg+,dNTP,rTaq)Primer 1 10 mM:0.25 ul 2.25ulPrimer 2 10 mM:0.25 ul 2.25ul ddH2O : 9.5 ul 85.5ul预混在1.5ml的EP管中,充分混匀,离心,分到8个PCR管中,20ul
5、/管,冰浴放置,菌落PCR和常规PCR的比较 菌落PCR: 常规PCR: 95 6 min 94 3min 94 40s 94 40s 58 32s 58 32s 72 90s 72 90s 35 cycle 3540 cycle 72 10min 72 10min,前变性94时间延长为6 min, 使得细菌能够充分破裂,DNA 大量释放并充分变性。循环次数减少是因为2535个循环的扩增量足够进行检测,如果量太大跑出的电泳条带呈现型,不易确定分子量。,一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽,形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带,多数不太亮,条带细而且不规则,有时拖尾设阴性对照,阳性克隆提取质粒酶切检测条带的分子量测序,检查点突变(最可靠的方法),思考题,用蓝白斑筛选,以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性,而不用蓝白斑筛选,有什么区别吗?蓝白斑筛选有什么作用吗?,THANKS!,