1、目的基因（珠蛋白基因）片段克隆以及阳性克隆的筛选 菌落PCR,邱逸敏基因工程与发酵工程教研室,DNA克隆的过程,获得目的DNA片断 (提取质粒DNA、PCR、酶切）载体DNA与目的基因连接转化受体细胞筛选转化子表达目的基因,连接反应后，可形成多种类型的DNA分子1.不带外源DNA的载体自连分子2.外源DNA彼此相连的多聚DNA分子3.载体与外源DNA相连的分子通过筛选鉴定： 1.有没有外源DNA 2.外源DNA的连接方式是否正确,重组子筛选方法,遗传检测法物理检测法菌落原位杂交法免疫化学检测法测序菌落PCR,遗传检测法 （1）抗药性记号插入失活选择法,（2） -半乳糖苷酶显色法筛选重组子-互补
2、作用,利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（ 半乳糖苷酶的底物）便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,菌落原位杂交,免疫化学检测法,对所有的转化细胞进行培养，把一张硝酸纤维膜均匀地压在含有许多单个菌落的培养皿表面，用碱处理膜，使细胞裂解，表达产物蛋白质将释放出来，加入带放射性的某一特定基因编码的蛋白质的抗体可与表达
3、产物蛋白质结合，自显影即可检出。,提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐； 蓝白斑筛选法需要载体有特殊的结构; 杂交筛选法除操作比较复杂外,尚需使用同位素;插入失活法仅适用于个别载体。本次实验中抗性平板上生长菌落数量众多，采用一种快速、简便的筛选方法菌落PCR,菌落PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。,操作步骤,在PCR管中加入PCR pre-Mix（已配好）为平板上将要挑取
4、的菌落标上号码（每组挑取8个菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至PCR管中（牙签在pre-mix中洗一下）用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至试管中（牙签在LB液体中洗一下），220rpm/mim过夜。设定PCR程序，开始PCR。电泳检测。,菌落PCR体系：20 ul 预混 9份2PCR pre-mix：10 ul 90ul (with Mg+,dNTP,rTaq)Primer 1 10 mM：0.25 ul 2.25ulPrimer 2 10 mM：0.25 ul 2.25ul ddH2O ： 9.5 ul 85.5ul预混在1.5ml的EP管中，充分混匀，离心，分到8个PCR管中，20ul
5、/管，冰浴放置,菌落PCR和常规PCR的比较 菌落PCR： 常规PCR： 95 6 min 94 3min 94 40s 94 40s 58 32s 58 32s 72 90s 72 90s 35 cycle 3540 cycle 72 10min 72 10min,前变性94时间延长为6 min, 使得细菌能够充分破裂,DNA 大量释放并充分变性。循环次数减少是因为2535个循环的扩增量足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现型，不易确定分子量。,一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽,形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带,多数不太亮,条带细而且不规则,有时拖尾设阴性对照,阳性克隆提取质粒酶切检测条带的分子量测序，检查点突变(最可靠的方法）,思考题,用蓝白斑筛选，以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用蓝白斑筛选，有什么区别吗？蓝白斑筛选有什么作用吗？,THANKS!,
