1、第 4 章 原代细胞的培养与建系细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至 1020 代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常用的基本技术。第一节 原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原
2、代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在 46h 内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于 4存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内 4存放，但时间不能超过 24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含 10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。（2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的
3、可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400 单位/mL）甚至加入适量的两性霉素 B 或 10%达克宁液的培养液内于 4下存放 2 小时以上，再用 PBS 洗 23 次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含 400 单位/mL 抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块） 、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（5）取材应注意组织类型、
4、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。二、各类组织的取材技术(一)皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般 24cm2即可，这样局部不留疤痕，若对烧伤皮肤进行上皮细胞膜片移植，可从大腿或臀部取较大皮片，可取 24cm2皮片，但取材时不要用碘酒消毒；若培养上皮细胞，取材时不要切
5、取太厚，尽可能去除所携带的皮下或粘膜下组织；若欲培养成纤维细胞，则反之。皮肤粘膜与外界相通部位，因表面细菌、霉菌很多，取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素 B 漂洗、浸泡。(二)内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织，否则培养后，由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难。对于一些特殊细胞培养的取材，详见后面有关章节。(三)血液细胞的取材血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸
6、腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为 810u/mL 血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。此外要严格无菌，尽量新鲜使用。(四)骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁 PBS 洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。具体操作详见后面有关章节。(五)动物组织取材1、鼠胚组织取材首先
7、用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有 75%酒精的烧杯中，5 分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力） ，取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开
8、游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。(六)人胚体组织取材在局部先用碘酒后用 75%酒精棉球消毒，无菌法取人胚肺（肾） ，方法与鼠类相同。(七)鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材取孵化至适当胚龄（912 天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用 75%酒精棉球擦干，经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳，再用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚，再用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。第二节 原代细胞的分离和制作人或动物
9、体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用 1mm3 的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用 1000r/min的低速离心 10 分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁 PBS 洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各
10、种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针） ，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于
11、处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状） ，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋
12、白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH 以及消化时间的长短等。细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的 pH 和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为 1:200 或 1:2
13、50，56pH8.0 时活力最强。该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为 0.1%-0.25%(活力 1:200 或 1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。温度 一般认为胰蛋白酶在 56时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为 37，通常在 37进行消化比室温作用快。pH pH8pH9 是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的
14、增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时 PH 只能选用 7.68.0 之间，否则对细胞有损伤。无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的 PBS 配制。消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为 20 分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于 4过夜也可。分离方法如下：过夜冷消化 将取得的组织用 Hanks 液洗三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右，用Hanks 液洗 23 次以除去血球和脂肪组织，再加入 0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放 4过夜，
15、次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 23 次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：热消化多次提取 将剪碎的细胞块加入 0.25%胰蛋白酶 37水浴中消化 1520 分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。冷消化多次提取 方法同上，只是消化温度为 4。先热消化后冷消化 将组织块先用胰蛋白酶于 37下消化 20 分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于 4下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。（2
16、） 胶原酶（Collagenase）消化法 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度 200u/mL或 0.10.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更
17、易生长，因此不必要再进一步消化处理。鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表 4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表 4-2） ，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用） ，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。表 4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项 目 胰蛋白酶 胶原酶消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多的组织用 量 0.01%0.5% 0.10.3mg/mL(200u/mL)消化时间 0.52 小时（小块） 112 小时pH 89 6.57.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间
18、过长有影响 无大影响血清、钙、镁离子 有影响 无影响表 4-2 胰 蛋 白 酶 和 胶 原 酶 在 不 同 温 度 下 消 化 各 种 组 织 小 块 时 所 需 时 间 (小 时 )(0.5 1cm3)较 硬 组 织 软 组 织酶 种 类4 室 温 37 4 室 温 37胰蛋白酶(0.25%) 2448 16 12 1224 12 0.51胶原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25两者联合(对冲) 1246 1224 412 1224 612 12除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的 Pro
19、nase 新酶分散细胞更佳。2、非酶消化法（EDTA 消化法）EDTA 是一种非酶消化物，又称螯合剂或 Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的 PBS 配成 0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1 或 2:1） ，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈 15mm3大小的组织块
20、。（2）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次（采用倾斜，自然沉降法） 。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37水浴中作用适当时间（中间可轻摇 12 次） ，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 34 层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不
21、高可采用倾斜自然沉降 510 分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。注意事项如下：（1）组织块必须漂洗 2-3 次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。三、原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化
22、等实验研究。原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样） ，但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁 24 小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延
23、伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，57 天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成 1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距 0.2 cm0.5cm，一般在 25mL 培养瓶(底面积为 17.5cm2)可接种 2030 小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在 37温箱内。(3)培养 24 小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放
24、，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养 24 小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养 35 天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。2.消化培养法该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。3.悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。4.器官培养器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外
