1、1藻相（藻水）养殖大鲵（娃娃鱼）不得病的基础研究金立成藻水是娃娃鱼人工养殖的重要因素，娃娃鱼存活率的高低取决于池中藻类优寡。养鱼就是养水，养水就是养藻。藻一方面吸收池中营养盐供自身生长与繁殖，另一方面净化水质，同时给娃娃鱼提供养料。池中氮磷硫既藻类养源，亦是病原菌、病毒的养源，当池中氮磷硫转化为藻类养源时，那么病原菌、病毒的养源就减少了，病原菌、病毒没有养源它无法分裂与繁殖，从而对水中生物构成不了威胁，也就是不能给水中生物形成感染，没有感染水中生物，那么水中生物自然就不会得病。一、微藻与大鲵抗病力大鲵养殖过程中 ,疾病的发生与大鲵抗病力和其环境因素有密切的关系 ,其中环境因素起着重要作用 ,它
2、不仅影响病原体的数量 ,也影响大鲵抗病能力 。大鲵疾病的暴发不与环境中致病菌与病毒数量呈正相关 ,更多的是由于生态系统的破坏和放养密度的增加而导致生态失衡的综合因素所致。大鲵养殖的水环境中有氨氮等有毒物质的增加 ,使大鲵的抗病力降低 ,即与大鲵抗病力有关的酶活力如 SOD 、POD 、 菌和抗菌活力等降低 ,血细胞数量减少 ,因而提高了对致病菌的易感染性 。本研究中对照组氨氮与亚硝酸氮明显高于其他各实验组 ,大鲵抗病力相关因子都相对较弱 。因此 ,水质恶化可导致大鲵生长环境平衡失调 ,从而增加了大鲵患病几率 。22、活藻抑菌实验： 本实验发现，五种微藻 N. oculata、I. galban
3、a、C. muelleri、T. chui、S. costatum 皆能达到降低 病原菌 生长，其中以 T. chui 抑制 病原菌生长效果最为明显，即浓度 104 cell/ml 环境中在 24 小时已完全抑制 病原菌 生长。但是随着 T. chui 浓度的增加，反而无法达到完全抑制 病原菌 生长的效果，而在浓度 105 cell/ml 环境中发现，24 小时后的菌量有上升之趋势，因此推断三种浓度在相同体积下，由于低浓度 104 cell/ml 培养出来年轻的藻体细胞较 105cell/ml、10 6 cell/ml 为多，以致于其活性最佳，进而与病原菌 在 同 一 水 体 中 相 互 竞
4、争 下 短 时 间 内可达到抑制 V.alginolyticus 的生长；添加 I. galbana 的抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可达到完全抑制 病原菌 生长之效果，其中以浓度 104 cell/ml 培养环境中较佳，72 小时可达到完全抑制 病原菌 生长；添加 C. muelleri 的抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可降低 病原菌 生长之效果，并且三种浓度皆在 72 小时可达到完全抑制 病原菌 生长之效果；添加 S. costatum 抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可降低 病原菌 生长之效果，且浓度 106cell/ml 环境下在 72 小时即可达到完全抑制 病原菌 生长之效果；添
5、加 N. oculata 抑菌实验中，可发现三种浓度皆可降低 V.alginolyticus 生长，其中以浓度 106 cell/ml N. oculata 环境下的效果最佳，在 72 小时达到完全抑制 病原菌 生长。Nieman (1954)和 Galbraith and Miller (1973a,b,c)指出，微藻的抑菌活性取决于脂肪酸碳链的长短，当脂肪酸连接 10 个以上的碳原子，会使细菌的活性降低，而在后期的研究报告亦证实了微藻的抗菌活性取决于脂肪酸链的长短 (Duff et al., 1966 3； Aubert et al.,1968a,b；Aubert and Gambarot
6、ta, 1972；Berland et al., 1972；Aubert etal., 1979；Gauthier, 1980；Cooper et al., 1983；Findlay and Patil, 1984；Pesando, 1985；Visco et al., 1987；Kellam et al., 1988)，另外苏 (1999)指出五种微藻 N. oculata、I. galbana、C. muelleri、T. chui、S.costatum 皆富含高度不饱和脂肪酸(DHA 及 EPA)，故推论本实验结果中的五种微藻皆会抑制 病原菌 生长的原因，可能是其所含有的不饱和脂肪酸皆为
7、碳原子 10 以上，所以有抑制 V.alginolyticus 生长的效果。Kogure et al. (1979)指出，利用不同的光度培养微藻 S.costatum (700、 3000、 9000 Lux)对于病原菌抑制的效果，其中以 3000Lux 抑制效果最佳，另外赵等 (2002)指出此五种微藻的最适培养光照为 30004000 Lux，这其中意味着当微藻在最适光照环境下，其生长速率较快，对于病原菌的抑制效果也最好。另外，研究报告也指出微藻在指数生长期间可有效的抑制病原性弧菌的生长(Waksman et al., 1938；Droop and Elson, 1966；Sieburth
8、., 1968；Bell and Mitchell, 1972；Simidu et al., 1977)。而本实验所设置 5 种微藻的培养光照范围为 25003500 Lux，并且实验初期所接种的微藻皆为指数期的藻种，而在此条件下所培养的微藻对于病原性弧菌 病原菌 的抑制皆有良好的效果，推测可能是因为此光照适合五种微藻在指数期的生长，而其生长速率上升会与病原性弧菌 病原菌 竞争营养盐及生长空间，进而达到抑制弧菌的效果。另外在本实验当中亦发现，将五种微藻震碎后，其细胞内产物亦有抑制病原性弧菌 病原菌 的效果，而本实验在活体抑制试验当中，所使用的微藻为指数期的活藻，但其中还是会有些许的的藻类会提早
9、老化死亡，这些藻类死亡后所释放出来的4胞内产物，可能对于病原性弧菌 病原菌 有抑制的效果，但有待进一步的实验来探讨其抑制的机制。比较五种微藻 S. costatum、C. muelleri、I. galbana、T. chui、N. oculata 对于病原性弧菌 病原菌 的抑制效果中发现，S.costatum 及 N. oculata 对 病原菌 生长抑制效果不如 T. chui、I. galbana、C. muelleri (Table. 15)。虽然 S. costatum 及 N. oculata 皆有抑制 病原菌 生长之效果，但是却要在最高的浓度 106cell/ml 才有最佳的抑制
10、效果，而 T. chui、I. galbana 及 C. muelleri 只要在低浓度的情况下就有抑制 病原菌 的生长，而在现场养殖环境中，若藻色过浓，常会有倒藻、清晨溶氧不足及底部缺氧的情况发生，故在抑制病原性弧菌 病原菌 生长的前提之下，建议以较低浓度的 T. chui、I. galbana 及 C. muelleri 三种微藻来做水，对于养殖池的管理较为容易。2.2 微藻细胞内产物实验： 微藻之细胞内产物抑制病原性弧菌的实验中显示出五种微藻皆能达到降低 病原菌 生长的效果。针对五种微藻在不同浓度下之抑菌实验中发现，C. muelleri 在浓度10 5 cell/ml 环境中抑制效果最
11、佳，24小时后即有降低菌量趋势，而在浓度10 6 cell/ml 环境下，48小时后菌量有明显下降趋势，但是在浓度10 4 cell/ml环境下，菌量呈现上升现象，因此推断在细胞内产物实验中，低浓度的 C. muelleri 不但无法抑制 病原菌 生长，反而成为 V.alginolyticus 之营养物质，进而促进菌量滋生。添加 I. galbana 的抑菌实验中，可发现 I. galbana 在浓度 105 cell/ml 环境中抑制效果最佳， 24 小时后即有5下降菌量趋势，而在浓度10 6 cell/ml环境下，原先菌量呈现上升趋势，而48小时后菌量即便明显下降，但是在浓度10 4cel
12、l/ml环境下，菌量呈现上升现象，其菌数甚至超越对照组，因此推测在细胞内产物实验中，低浓度的I. galbana 不 但 无 法 抑 制 病原菌 生 长 ， 反 而 成 为 V.alginolyticus 之营养物质，进而促进菌量滋生。添加 S. costatum 的抑菌实验中，可发现 S. costatum 在不同浓度环境下皆可降低 病原菌 生长，以添加不同浓度的骨藻之细胞内产物对生长之影响(Fig. 17)结果显示，发现各个处理组其菌量呈现一个平稳状态，且与对照组比较之下，菌量明显较低，因此推测S. costatum 之细胞内产物中，可能含有某些酵素或其他成分可以抑制 病原菌 生长，添加
13、N. oculata 的抑菌实验中，发现 N. oculata 随着浓度的提高其菌量明显的降低，在浓度 105 cell/ml 环境中 72 小时菌量有下降的趋势，而 106 cell/ml 环境中在 96 小时也有菌量降低之现象，因此推测在细胞内产物实验中 N. oculata 在低浓度环境下无法抑制 V.alginolyticus 生长，反而成为 病原菌 之营养物质，进而促进菌量6滋生。添加 T. chui 的抑菌实验中，可发现 T. chui 在初期时三种浓度皆无法降低 病原菌 生长，且菌量明显比对照组高，而后在 48小 时 浓 度 106 cell/ml 环 境 下 其 菌 量 急 速
14、 下 降 ， 转 为 抑 制 V.alginolyticus 生长，因此推测在细胞内产物实验中，低浓度的 T. chui不但无法抑制 病原菌 生长，反而成为 病原菌 之营养物质，进而促进菌量滋生。微藻之细胞内产物抑制 病原菌 生长之实验中，经由实验结果推测出五种微藻在浓度 104 cell/ml 环境下除了S.costatum 以外，其余四种微藻皆无法降低 病原菌 生长；105cell/ml 环境下 I. galbana、C. muelleri、S. costatum 可降低 V.alginolyticus 生长，而在 72 小时以后，N. oculata 也有菌量降低之现象；在 106 ce
15、ll/ml 环境下，五种微藻皆可降低 病原菌 生长综合细胞内产物实验结果，故推测以添加 S. costatum 有最佳之抑制效果，主要为此微藻不管是低浓度或高浓度皆可降低 V.alginolyticus 的生长。早期的研究报告证实了Chaetoceros spp.、 T. suecica、S. costatum确实能够降低弧菌属的滋生(Table. 20) ，而综合本实验结果证实了微藻确实能够7有效抑制 病原菌 ，活藻的抑制实验发现，其可与病原菌之间达到竞争营养盐、空间或者以脂肪酸类的物质抑制弧菌的生长；在经震碎后的细胞内产物中也发现，微藻细胞内可能含 有 抑 制 病 原 菌 生 长 的 物
16、质 ， 其 中 包 含 了 autoinhibitor(15-hydroxyeicosapentaenoic acid)，究竟抑制细菌的物质为何，有待进一步实验探讨。8三、微藻抑制病原菌作用1. 林伟等研究微藻抑制病原菌机理示意图910试验结果：微藻与菌混合液能显著抑制弧菌生长2.张学超、杨立平对虾育苗中常用海洋微藻抑菌作用的研究研究了等鞭金藻 、 角褐指藻 、 藻对对虾育苗中致病菌鳗弧菌 、 单胞菌的抑菌效果 。结果表明 ,等鞭金藻 、 角褐指藻 、 藻的水溶性物质及脂溶性物质对鳗弧菌有抑制作用 ; 等鞭金藻 、 角褐指藻的水溶性物质及等鞭金藻 、 角褐指藻 、 藻的脂溶性物质对假单胞菌有抑制作用 。在抑菌试验中 ,等鞭金藻 、 角褐指藻 、 藻密度达 10 104 / ml 时 ,对对虾育苗池水的抑菌作用较好 ,特别是对弧菌的抑制效果明显 。
