1、实验 1 植物叶绿体 DNA 的提取、PCR 扩增与电泳观察【实验目的】1、学习从新鲜的绿色叶片中提取叶绿体 DNA 的方法2、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 的操作方法3、学习和掌握 PCR 实验的原理和操作方法【实验原理】叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有相对独立的遗传物质叶绿体基因组DNA（ctDNA），大小在120160 kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。由于cpDNA相对保守及其重要功能，已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等多方面的研究，而获得纯度高、产量好的、结构完整的ctDNA是开展相关研究的前提条件。然而ctDNA的提
2、取是限制深入研究的重要因素，传统的提取方法包括梯度离心提取ctDNA的方法，对设备要求高，成本高，耗时长产率低。因此，我们要尽可能快速、简便地获得质纯、量大的ctDNA一般来说获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA很难，主要是因为叶绿体DNA含量太少同时在提取中有诸多因素干扰(如：核DNA、RNA、蛋白质等)。本实验通过改进部分传统操作，提取叶绿体基因组DNA，同时利用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验检验提取效果。【实验仪器与试剂】1、 器材：剪刀、烧杯、移液器、枪头、量筒、匀浆器、纱布、300 目尼龙网、注射器、离心管、滤膜2、试剂： 酶液：1%纤维素酶、0.6mM 蔗糖、8mM CaCl22H2O、1
3、0mM NaH2PO42H2O，pH5.6 洗涤液：0.6mM 蔗糖、8mM CaCl22H2O、2mM NaH2PO42H2O，pH5.6 10%SDS 溶液 A：25mM EDTA，50mM Tris，pH=8.0 Tris 饱和酚，氯仿，异丙醇，TE，琼脂糖，gold view，Loading buffer，DNA marker 新鲜叶片 PCR Buffer、Mg 2+、dNTP、上、下游引物、ddH 2O、Taq DNA 聚合酶【实验步骤】一、 叶片采集采集适量新鲜绿叶（约 10g）二、 细胞破碎首先利用剪刀将叶片剪碎，然后放于匀浆器中，先加入不含酶的酶液进行匀浆，弃渣，将液体转移至
4、烧杯中，加入纤维素酶至终浓度为 1%后搅拌均匀，50 度水浴约 30 分钟。三、 叶绿体分离将经酶液处理的液体取出，依次用纱布和 300 目尼龙网与大注射器过滤，取滤液。1、 用电组：将上述滤液转移至 50mL 离心管中，3000rpm 离心 3 分钟，弃上清。用10mL 洗涤液重悬洗涤后 3000rpm 离心 3 分钟，弃上清，洗涤两次后，即分离得到叶绿体。2、 不用电组：利用大注射器及 0.2m 滤膜过滤上述滤液后，将滤膜上的叶绿体刮下，转移至 1.5mL 离心管中，即分离得到叶绿体。四、 DNA 提取1、用电组： 向叶绿体中加入 500L 溶液 A 把叶绿体悬浮，转移至 1.5mL 离心
5、管中。 加入 200L10%SDS（裂解叶绿体膜，释放 DNA） ，混匀后静置 2min； 加入 350L 苯酚（使蛋白质变性）+350L 氯仿（与苯酚互溶，易于除去苯酚） ，混匀，10000rpm 离心 2min； 转移上层液体至新的离心管中，加入等体积氯仿（去除苯酚） ，混匀，10000rpm 离心2min； 转移上层液体至新的离心管中，加入 0.6 倍体积异丙醇（沉淀 DNA）沉淀 10min； 10000rpm 离心 5min，弃上清； 加入 500L70%乙醇（去除盐离子）洗涤沉淀，10000rpm 离心 5min，晾干； 30L TE 溶解 DNA；2、 不用电组： 向叶绿体中加入
6、 500L 溶液 A 把叶绿体悬浮； 加入 200L10%SDS，混匀后静置 2min； 加入适量 KI 固体至饱和后静置至出现明显分层； 将下层透明液体转移至 DNA 吸附柱中，用洗耳球将液体吹出，DNA 吸附于硅胶膜上，弃液体； 向吸附柱中加入 500L70%乙醇，用洗耳球吹出，弃液体，晾干； 将吸附柱至于新的 1.5mL 离心管中，用 30L TE 溶解 DNA，用洗耳球将液体吹入离心管中。五、 PCR 扩增特征条带25L 体系：PCR Buffer 2.5LMg2+ 1.5LdNTP 2.0L上、下游引物 各 2.5L 加至 PCR 管中ddH2O 8.0LTaq DNA 聚合酶 1.0LDNA 模板 5.0LPCR 结束后，取 5 L 在 O8的琼脂糖上电泳，观察。六、 叶绿体 DNA 的电泳观察取提取的叶绿体 DNA 5 L 在 O8的琼脂糖上电泳，电泳 1h 后，使用自制的 LED灯进行观察。【实验结果与讨论】1、为保证叶绿体 DNA 的含量和纯度，在本实验操作中，样品前处理、抽提、纯化等操作中应注意什么？2、提取不同种植物的叶绿体 DNA，比较、分析实验结果。
