1、细胞工程学习指导绪 论1. 细胞工程学的概念 它是应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2.植物组织培养的含义（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 （狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在细胞工程学习指导 高丽萍2培养过程中从各器官上产生愈
2、伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。3.植物组织培养技术的发展及意义： 1902 年德国植物生理学家 Haberlandt 提出了“细胞的全能性”原理。1962 年 Marshing 和 Shong 发明了 MS 培养基. 加速无性繁殖;获取脱毒苗;扩大变异范围：克服远缘杂交后代不育性和杂交不亲和性。通过原生质体融合获得体细胞杂种和胞质杂种。倍性育种：通过胚乳培养获得三倍体；通过花粉和花药培养进行单倍体育种。结合诱变育种在试管内进行优良变异的诱导.选择和繁殖。加速亲本材料的纯化。一般选育自交系需 46 代花粉培养获得单倍体植株，染色体加倍后即为纯合二倍体。种质资源的试管保存。为基因
3、工程的全面实施人工控制遗传方向打下基础。第一篇 植物细胞工程第一章 实验基本技术原理1. 基 本 实 验 室设计准备室 进行药品的保存、配置、消毒、分装等。器具的洗涤、干燥、消毒。 生理生化指标的测定等。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室 进行材料的接种。外设缓冲间放置拖鞋.工作服.工作帽等。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。 培养室 植物材料的无菌培养。外设缓冲间放置拖鞋.工作服等。首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。细胞学实验室 进行培养材料的组织学.细胞学.观察照相等。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 生化分析室 在
4、以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化基本设备配置验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 2.灭菌方法有哪些，各有何利弊1.高压蒸气灭菌；2.燃烧灭菌；3.干热灭菌：易引起火灾；4.射线 灭菌：适于不耐高温材料。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌. 玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌. 金属器皿：干热灭菌. 接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾 3.培养基基本类型MS-无机盐浓度高，微量元素种类齐全，养分均衡。应用最广，特别是培养再生植物。B5-含较高硝酸盐、较低的铵盐，较高的VB1，用于细胞悬浮和原生质、葡萄、豆
5、科植物的培养。N6-较高硝酸盐、较低的铵盐，禾本科花药培养和柑橘类植物的花药培养。.Nitch-无机盐浓度高，White-低盐培养基，用于生根培养。4.培养基基本成分水-水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95。 原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水.如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。无 机 盐类大量元素-培养基的使用量一般在每升几十至几千毫克。包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S 微量元素 -微量元素的用量一般低于10 -510 -7克分子浓度。有Fe、Cu、Zn、B、 M
6、o、Mn、Co糖-是碳源和能源，多利用蔗糖， 维生素-B1是必需的，B6、烟酸等，原生质培养含有大多数基本维生素。 氨基酸-细胞原生质培养特别需要，水解酪蛋白， 细胞工程学习指导 高丽萍3激素-细胞分裂素-BA（6苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（异戊烯酰嘌呤，生长素-2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制琼脂 、卡拉胶-固体培养活性炭 -防止外植体变褐附加复合成分-椰子汁、酵母提取液5. 培养基的固化剂有哪些，作用是什么?琼脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃丝、岩棉、玻璃珠、Gala胶。作用：束缚水分、吸收化合物6.常有哪些物质需过滤消毒I
7、AA、ZT、GA3及某些维生素、抗生素、酶、植物提取物、秋水仙素等。7. 培养方式固体培养-培养基中加入0.6-1.0%琼脂、卡拉胶等，液体培养-无凝固剂，分静止、震荡悬浮培养两种悬浮培养-成批、半成批、连续培养单细胞培养-微室、平板、看护培养8.外植体概念及其选择外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料外植体的来源-用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源： 一是生长在自然环境下的植物； 二是有目的培育、在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已经离体培养的植物。 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体；一、二年生草本植物的离体培养比多年生
8、植物容易；生长季节和营养生长阶段生长启动快、分化快。木本植物的预处理-可将成年树的芽嫁接在实生苗上，或修剪促其新枝条产生，或对亲本植株进行高水平施肥，或用细胞分裂素喷洒植株，或进行扦插繁殖等多种措施，使亲本植株部分地返回年轻状态之后，再从亲本植株上采取外植体，这些措施有可能提高成年树外植体的活力9.防止离体培养中材料变褐的方法对培养基的防褐有三种方法：一是在培养基中加抗坏血酸、柠檬酸或半胱氨酸；或用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；或是在培养基中加入1的活性炭吸附褐色醌类物质；或加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化二是减少光照强度或在黑暗条件下培养三是将外植体不断地
9、转移到新鲜培养基，最好的办法是外植体在瓶内转移到无褐色物质的部位。这三种方法以第三种瓶内转移法最简便、经济(节省培养基)和有效。10.植物材料的常规消毒步骤1.预处理修理。2.消毒：消毒液浸泡。3.材料内部带菌处理。11. 植物材料内部带菌处理方法1.茎尖分生组织培养。2.培养基中加入抗生素。12. 外植体灭菌方法一次消毒程序-先将采集的植物材料用纱布或尼龙网扎紧瓶口置于流水条件下冲洗数小时。接着用7075的酒精漂洗植物材料数秒至半分钟，以破坏有些植物材料蜡质化表面的张力。再用消毒剂消毒。二次消毒程序-即在外植体培养3d左右再行一次消毒。灼烧法消毒-有的植物材料如胡萝卜储存根可采用，即将块根于
10、95酒精中浸一下，置于酒精灯上灼烧，然后去除表面层，切取无菌韧皮部接种培养。降压法-即将植物材料与消毒液一起置于真空抽气瓶中抽气，以使消毒液渗入植物材料的表面，达到消毒细胞工程学习指导 高丽萍4的目的。浸没法-如五针松枝条，可浸没在较低浓度的次氯酸钠(钙)消毒剂中浸泡一段时间，然后按常规消毒程序再进行一次消毒，效果也甚佳。木本植物消毒-在树木冬季休眠期采取休眠枝条，经灭菌后放于2-4冰箱冷藏40-50天，以破除休眠；然后取出枝条再经灭菌，放入40-50 温水中（无菌水），在温室中进行温浴2-4小时；再浸泡在含有细胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30 温室中及连续光照下催芽，当枝条长到6-8厘米是
11、即可采取常规消毒方法取茎芽切段进行离体培养，13.详述影响组培的因素植物因素：基因型，植物年龄，组织和器官的年龄，植物的生理状态，取材年份及生长条件，取材部位及大小。培养基因素：无机盐；有机化合物；植物激素；天然提取物；琼脂；PH值；渗透压；活性炭。.环境因素：光照：包括光强.光质.光周期。温度。湿度。气体。14.控制组培中形态建成的激素模型生长素与细胞分裂素的比例15.植物激素的主要生理作用影响培养中器官建成16.离体培养条件及其控制光照： 组织培养通常在散射光线下进行。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形
12、成芽和根（光照时间影响植株再生状态） 温度：在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。 对大多数植物组织2028即可满足生长所需，其中2627最适合。渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常12个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。通气： 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可
13、采用专门的通气和搅拌装置。PH：通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。第二章 细胞全能性与形态发生1.细胞的全能性totipotency概念指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。条件是有生命力的核和完整的膜系统。 细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应; 即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体; 动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。2.名词解释外植体explant：从植物体上
14、分离下来的用于离体培养的材料。分化differentiation：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。脱分化dedifferentiation:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。再分化redifferentiation:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。细胞工程学习指导 高丽萍5愈伤组织callus:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。胚状体embroid:对应于胚embryo，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明
15、显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。3、脱分化细胞的特点细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。在这些变化中，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。4、细胞脱分化的调控机理细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程 细胞周期蛋白（cyclin）和依赖周期蛋白激酶(CDK cyclin-dependent kinase)是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子（CKI cyclin-depe
16、ndent kinase inhibitor）的负调节。 植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。 5、细胞脱分化与愈伤组织形成细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂， 脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。 尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。 愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的，即同一愈伤组织
17、内的细胞之间其状态存在一定差异，特别是在组织器官培养时，往往出现部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其很容易再分化再生植株，这对培养来说无疑是十分有利的。6、细胞分化概念及其特点指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化； 同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的分化从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。通常把离体培养中TE（TE trache
18、ary elements）细胞的出现作为组织分化的标志7、极性（polarity）所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。 8、影响脱分化和再分化的因素激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样
19、。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高9.根据外植体不同可分为几类?胚胎培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。细胞工程学习指导 高丽萍610.根据培养方式不同可分为几类?固体培养，液体培养，半固体培养，双层培养。11.简述离体培养中植株的形态建成通过愈伤组织分化芽，再分化根。直接分化芽和根。直接分化根，再分化芽。外植体直接产生胚状体。12. 植物的离体器官发生方式及过程离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程器官发生方式-有先生芽后生根
20、、先生根后生芽、根芽同时生长三种方式器官发生过程-有经过愈伤组织的器官发生过程和不经过愈伤组织的器官发生两种过程。第一种过程是从愈伤组织-生长中心-器官原基第二种过程中一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。 13.器官发生途径中芽再生方法有哪些？诱导腋芽。诱导不定芽。从茎尖或顶端分生组织中诱导。14.愈伤组织类型及特征结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多
21、为淡黄色或白色，易于再生芽结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立。胚性愈伤组织：具有产生胚状体能力。15.影响芽分化的因素外植体：种类及基因型，外植体供体植株及外植体本身生理生化特征，包括供体植株年龄、发育阶段、生长环境、取材位置，外植体大小，外植体极性培养基成分：基本培养基，生长调节物质，其它成分环境条件：光，温度16.起始材料对器官分化的影响总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力 同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已
22、是不争的事实。 基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上 ，来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养 。对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。 一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。 17.光照对器官分化的影响光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。 培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不
23、是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。 光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关细胞工程学习指导 高丽萍718.体细胞胚或胚状体概念离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，单细胞起源，以区别于合子胚； 其三，体细胞发育程序同合子胚相似，经过了胚胎发育过程，也经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚，以区别与离体
24、培养中器官发生形成个体的途径其四，和周围细胞之间有隔离。其五，和培养物质没有维管束联系，所以容易从培养物质上剥离。其六，可以在不附加任何激素的培养基上萌发。19.体细胞胚的形成途径直接胚状体发生-细胞胚从外植体上直接产生。间接胚状体发生-经过愈伤组织的体细胞胚形成，或经过悬浮细胞的体细胞胚形成。由花粉产生的单倍体胚状体。由原生质体产生胚状体20.体细胞胚的发育结构特点与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点： 一是体细胞胚具有双极性（doulble polarity）；有分化明显的生物两端，根端和芽端。二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离
25、（physiological isolation）现象。与合子胚比较： 合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构； 合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范；与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚；在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异；并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。 合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株；在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。胚状体原始细胞特征：原生质浓厚，细胞核较大，
26、处于细胞质中央。胚状体异常现象单片子叶；多子叶；杯状胚状体；柱状胚状体。21.影响体细胞胚发生的因素激素的调控作用-2,4-D是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。 细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作
27、用。 22.体细胞胚培养的培养基及培养条件的影响培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，一些氨基酸可以代替还原态氮的作用，一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。 一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率第三章 原生质体培养及体细胞杂交细胞工程学习指导 高丽萍81、 原生质体的概念 原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没
28、有细胞核。 核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。2、原生质体研究进展 植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就： 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。据统计，目前已有49个科，146个属的320
29、多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。3、原生质体研究的意义植物原生质体之所以能成为植物细胞工程的理想研究材料，是因为它具有以下重要特点：易于从同一种植物材料的组织中获得大量的遗传上同一的游离原生质体，为植物细胞的遗传操作的微生物化奠定了基础；可以像动物细胞一样，被诱导与其他物种的原生质体融合，从而有效地克服了不同物种细胞之间的有性不亲和障碍，为实现远缘物种间的体细胞杂交，培育新种提供了新的手段；它既可以捕获外源 DNA，也可以捕获较大的细胞器，如病毒颗粒、叶绿体、线粒体等，因此是植物遗传转化的
30、理想受体；保持着植物细胞的全能性，在适宜的培养条件下，可以重新长出细胞壁，进行细胞分裂、分化，形成完整的小植株；植物原生质体虽然没有细胞壁，但仍然进行着植物细胞的各种生命活动，包括蛋白质和核酸的合成，光合作用，呼吸作用，通过膜向外界进行物质交换等。4、制备原生质体的外植体、预处理及分离措施用于分离原生质体的常用材料是无菌试管苗叶片,上胚轴和子叶, 培养细胞预处理条件：在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。 叶片脱壁方法：酶包括纤维素酶
31、、果胶酶处理，其浓度比例随年龄和生理而变化。5、 原生质体的收集和纯化方法飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。 6、原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与
32、否确定活性。 7、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响8、 原生质体培养基细胞工程学习指导 高丽萍9大量元素浓度中注意 NO3和NH4+的比例；Ca2+浓度；有机成分中含有维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 培养基注意调节常用渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 9、 原生质体培养方法及其优缺点液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄
33、层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 固体平板培养固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在30C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的 生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。 优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点：是操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀
34、。液体固体双层培养即在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50l一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生
35、质体的分裂和细胞团的形成。 10、原生质体发育与植株再生细胞壁的再生 -原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。 只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂的阶段。 细胞分裂和生长 -原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂。一般原生质体培养27 d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。愈伤组织形成-大多数情况下原生质体培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1 mm的小
36、愈伤组织。原生质体培养710天后必需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。植株再生-将原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。然而，越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。11、影响原生质体培养的主要因素 基因型 -较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。 原生质体的来源 - 供体材料体类型 向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体的培养，结果只有下胚
37、轴原生质体培养后得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成功。 供体细胞的分化程度 - 同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，它们的生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以便提高原生质体的细胞分裂频率和再生能力，并且可以提高试验的重复性。起始培养密度与培养基激素水平 -基本起始密度 适宜密度为110 5/ml左右 12、植物细胞杂交的几个重要进展1960 年，Kocking 用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971 年，Takebe 首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；细胞工程学习指导 高丽萍101972 年，Carlson 首次获得粉蓝烟草和郎氏烟
38、草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种；1974 年，Kao 将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978 年，Melchers 获得了第一个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；1981 年，Zimmerman 发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987 年，Schweiger 建立了单对原生质体电融合技术程序。13、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传
39、系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 DNA 亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。14、原生质体融合类型根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 对称融合（asymmetric fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合， 15、细胞核或细胞质失活的方法用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：物理方法常采用射线处理，如 X 射线、射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活罗丹明
40、（R6G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 16、 原生质体的融合 方法 PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。PEG 的作用机理： Kao 等认为，由于 PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H 键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG 能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 电融合法 与 PEG 融合比较起来有三大优点
41、： 不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高； 融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点： 交变电场部分 高频直流电击部分。电融合的基本过程： 细胞膜的接触-当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿-原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数-交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、 脉冲次数 17、影响原生质体融合的因素 原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件; 融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 18、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定杂种细胞的选择系统： 外观选择：质体、细胞体积等 互补选择：抗生素、营养缺陷型等 荧光标记选择：亲本标记不同荧光 体细胞杂种的鉴定：形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP 鉴定、RAPD 标记鉴定。体细胞杂种的特点 ：变异幅度大，非整倍性，双亲性状的共显，性偏亲现象。
