1、组织学与胚胎学,(临床医学专业)组胚教研室制作,实验一,目的1、掌握光学显微镜正确使用方法 了解石蜡包埋术的基本程序2、脊神经节细胞光镜结构,绪 论,组织学教学过程包括理论课和实验课两部分。实验课的目的主要是通过显微镜观察组织切片的经典技术方法，验证和巩固所学的理论知识；加深、扩大对所学知识的理解；掌握正确使用光学显微镜的方法，并培养同学们观察、比较、分析、综合各种客观现象的思维方法和独立思考的能力。,实验室规则(1)上实验课时，不得迟到或早退，有事须向任课老师请假。(2)保持实验室清洁，不得随地吐痰、乱仍果皮、纸屑等污物。(3)保持实验室安静，不得大声喧哗，有问题时可以与邻近同学小声讨论或举
2、手请教老师。(4)爱护室内公共财务，如有损坏，照价赔偿。(5)实验完毕，必须整理好切片，将显微镜及切片盒放回原处；值日生要整理好卫生，关好门窗及日光灯。,一、一般光学显微镜的构造及其使用方法 和保护（一）光学显微镜的构造 一般光学显微镜的基本结构包括两部分：机械部分和光学部分。 机械部分主要包括下列部件：,.镜座.镜臂.载物台.镜筒.物镜转换器.粗调螺旋7.微调螺旋,1,2,3,4,5,6,7,光学部分主要包括：反光镜、聚光镜、目镜和物镜。1.反光镜2.聚光镜3.物镜4.目镜,1,2,3,4,(二)光学显微镜的使用方法低倍镜的使用：1.对光：转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使10倍
3、物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。2.将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位移至中央。3.调焦距：旋转粗调螺旋，升高载物台，至物镜距玻片约0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。4.调节两瞳孔间的距离：一边用双眼自目镜中观察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视野为止。5.为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。,高倍镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，将光
4、线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。油镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至视野中央，在标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜头下端与镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈充分开大。 用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，将镜头和玻片擦净。,（三）显微镜的保护1.搬动显微镜时，应该用右手握镜臂,左手托镜座，平贴胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，前后摇摆。2.每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。3.
5、禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许与其它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。4.如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允许用口吹、手指抹，或用其它纸、布擦。 5.显微镜用完后，将4倍镜头对准镜台孔，升高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放回原处。,（四）标本观察注意事项1.取切片标本时，一定要认清标本盒的反正，其正面（有字的一面）朝上，方能打开盒盖。按号取出标本，用完后，按号放回，损坏要赔偿。2.观察标本时，先用肉眼观其大体形态，再用低倍镜观其一般结构，需要进一步观察的部位，换用高倍镜，一般不用油镜。放标本时，一定要使有盖玻片的一面向上。旋转调节螺旋时，动作要轻;低倍镜换高倍镜时，注意不
6、要使镜头碰到切片。3.观察切片时，注意力要集中，密切联系课堂所学理论，有步骤地进行观察。要求课前复习有关理论，预习实验指导，以便在课堂上作到主动。,4.绘图时，要选择结构清楚的部位，不要抄画，也不要乱画。图上的注字要清楚、端正(使用红蓝铅笔)。图的布局：,中等动脉横切片，HE 染色，X100,5.观察标本时，要注意组织细胞的断面形态与立体形态的关系。同一细胞或组织，在不同的断面上，其形态不一样。,石蜡切片术,目的：了解组织学标本制作的程序和各步骤的作用。标本制作的要求：为了在光学显微镜下观察机体的正常微细结构，一定要把组织制成适合于在显微镜下观察的标本。 尽可能保存组织生前结构；标本要透明，可
7、容显微镜下的光线通过；不同的结构在显微镜下必须能显出不同影像；标本可长期保存以供长期观察。,石蜡切片标本制作法,基本程序：取 固 脱 包 切 染 封 材 定 水 埋 片 色 片,取材/固定：,杀死后，应立即进行取材和固定，以停止其分解作用。尽可能保存细胞组织生前结构和成分。1. 取材：即从动物体内取下器官或组织材料的过程。以取肝脏为例，取材的步骤为：将动物麻醉或杀死后，腹部向上固着在蜡盘上，打开腹部，暴露肝脏，用锋锐的解剖剪或手术刀细致而又迅速地取下一块大小适宜（0.5cm3）的肝脏组织块，立即投入固定液内。2. 固定：固定是将组织用化学试剂浸泡，使其蛋白质等成分迅速凝固，尽量保持其生前形态结
8、构而不发生死后的变化。固定时所使用的化学溶液，称为固定液。常用的固定液配方：(1)Susa液：液氯化汞(升汞)饱和水溶液50.0ml液氯化钠0.5g三氯醋酸2.0g冰醋酸4.0ml甲醛（40）20.0ml蒸馏水30.0ml使用时取等量的液和液混合后，将组织块投入，固定24小时。(2)Helly干液：重铬酸钾2.5g氯化汞5.0g硫酸钠1.0g蒸馏水100.0ml使用之前加入40甲醛5.0ml。(3) 10甲醛：40%甲醛10.0ml蒸馏水90.0ml(4)Bouin液：苦味酸饱和水溶液75.0ml40%甲醛25.0ml冰醋酸5.0ml(5)Carnoy液：无水酒精6份氯仿3份冰醋酸1份,脱水、
9、透明、浸蜡、包埋,几个步骤是为了将组织包埋在较硬的物质即石蜡中，以便制备较薄的石蜡切片。1. 脱水：普通固定液大多是水溶液，必须先脱去组织内的水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常使用酒精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度，以去净组织块内的水分，最后完全由纯酒取代。Susa液固定的组织块，须先入含碘的95酒精，脱水并脱去组织内的汞沉淀，然后入无水酒精。10甲醛液固定后的组织块，脱水时应依次经过70、80、90、95酒精和无水酒精。2. 透明：因石蜡不溶于酒精而溶于二甲苯，因而组织块经脱水后须再用二甲苯置换出酒精。组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明，故此步骤称为透明。透明时间根据组织块的大小及性质而定。
10、3. 浸蜡：将透明好的组织块置入已在温箱（5860）内熔化的石蜡内，放置适当时间，使石蜡浸入组织并替换出二甲苯。4. 包埋：在包埋器的内壁涂一层甘油，倾入熔化的石蜡，将浸透蜡的组织块放入包埋器，摆好间距和方位，俟蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固。包埋后的组织蜡块，经过修整即可用于切片。,切 片,以LEICA RM2135型切片机为例介绍切片机的一般结构： 标准标本固定夹、标本修剪器水平调节装置、E型持刀架、持刀架前后移动调节轮、持刀架左右移动手柄、持刀器角度设定和清除锁定装置、刀锋夹杆随意调节装置、切片刀防护杆、粗标本推进手轮、切片厚度调节旋钮、切片厚度指示、细标本推进手轮
11、、手轮锁定装置、手臂托、切片机底座等部件。 图1-1 LEICA-RM2135型切片机的结构 标本固定夹 持刀器角度设定和清除锁定装置 粗标本推进手轮 切片厚度调节旋钮 切片厚度指示 细标本推进手轮,染色、封固,染色的目的是使组织内的不同结构染上不同颜色以便于在显微镜下观察。 染色的方法很多，可根据研究目的选用。组织学和病理学教学标本的基本染色方法是苏木精-伊红染色。该方法可将细胞核染成蓝紫色，细胞质染成粉红色，使细胞结构对比分明。现将该方法介绍如下，至于在实习过程中遇到的其它特殊染色法，将分别介绍于首次出现之处。苏木精-伊红染色（简称HE染色）：,神经节:周围神经系统神经元胞体集中的部位,尼氏体,
