1、细 胞 融 合牛蛙红细胞的体外融合,了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。通过PEG诱导牛蛙血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。熟悉用血细胞计数板计数细胞。,目的要求,同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交（cell hybridization）， 是指将不同来源的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂交细胞（hybrid cell），此杂交细胞具有很强的生
2、命力，增殖旺盛。常用方法：生物方法、化学方法、物理方法。,概 念,细胞融合的原理,膜结构：脂质双分子层，流动镶嵌模型细胞膜的流动性：环境因素等诱导因素使细胞膜的脂类分子的有序排列改变,融合过程中两个细胞膜的变化过程,类脂质分子发生疏散和重排导致细胞桥的形成细胞质、核相互融合,显微镜下的细胞融合过程,发展历史,Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）
3、的血液细胞发生合并的现象。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。真正意义上的细胞工程诞生了。细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。,细胞融合的方法,生物法 、化学法及物理法。原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性随机结合、融合,
4、1、生物因素：仙台病毒研究最早的促融剂。毒性大而使应用受到限制。仙台病毒（HVJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HVJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。活性与其被膜的磷脂成分有关：糖蛋白、神经氨酸酶的突起,原理与过程,灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37下1-2分钟），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。,3、物理法电融合诱导法,在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状在直流电
5、脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。,融合方法选择,具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法；微生物细胞融合只适用PEG法 。,次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）,次黄嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）,氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂,PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体
6、，具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。 PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。使用方便，但有一定毒性，有些细胞不适用。,实验原理(化学法),（一）融合剂聚乙二醇（PEG），在分子量为200700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0pH8.2（用10%N
7、aHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,融合过程,两细胞（或多细胞）的接触、粘连。两细胞（或多细胞）的细胞质连通。通道扩大，两细胞（或多细胞）连成一体。细胞完全合并，形成一个含有两个（或多个）核的细胞。注意区分细胞融合和细胞重叠。,牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬
8、液放入离心管 加入4ml Hanks液混匀 1000 rpm/min离心5min弃去上清液，轻弹离心管混匀细胞 PEG诱导细胞融合：吸取0.5ml 37的50% PEG溶液 ，在37水浴中慢慢沿着离心管壁逐滴加入10滴，边滴边摇 在37水浴中静置2min终止PEG作用 ：缓慢加入5 ml Hanks 液，轻轻吹打混匀，于37水浴中静置5min制备细胞悬液：用吸管混匀，1000 rpm/min离心5min 弃去上清液，加入Hanks液2.5ml ，再混匀、离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀细胞,方法与步骤（融合）,染色和镜检：载玻片上加滴细胞悬液和滴詹纳斯绿染液混匀，染色 3min 盖上盖玻
9、片后镜检（观察两个高倍视野细胞融合情况） 细胞融合率：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。 融合的细胞核总数/所有细胞核总数100%,方法与步骤,牛蛙血细胞的获得 ：心脏采血、肝素抗凝牛蛙血细胞储备液的制备 ：加4倍体积的0.85% NaCl溶液，4保存牛蛙血细胞悬液的制备：1ml储备液加5ml 0.85% NaCl溶液离心洗涤(1200转5分钟) 2次，弃上清液，加入10ml GKN溶液混匀制成细胞悬液计数：牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬液加入4mlHanks液混匀，取10l加入计数板计
10、数（2个或4个大方格）。 原则：压线的细胞数上不数下，数左不数右,血细胞悬液制备及计数,细胞计数板,注意事项,每个吸取细胞悬液的步骤，均要注意混匀细胞且要轻柔。必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞12分钟。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高细胞的融合率。计数板充液应一次充完，避免产生气泡，静置12分钟后计数。注意区别血细胞计数板的血盖片与一般的盖玻片，计数板、血盖片用清水冲洗后，擦干收回。,细胞浓度(个/ml)=个大方格内的细胞总数/410103稀释倍数细胞融合率(%)=两个视野中融合的细胞数/两个视野中的细胞总数100%,作 业,思考题,预习：实验27,制备小鼠染色体之前如何
11、处理小鼠，为什么？对比小鼠骨髓细胞与人体外周血白细胞染色体制备的异同点。,P50：1、2,（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活?57天，无需特别筛选 ，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。细胞的DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。细胞融合的选择?嘌?杏腥?种关键成份：次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨甲喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字头称为HAT培养基。氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT- 细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖,
