1、亲和层析法纯化抗体【相关帮助】 需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎fantibody 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址：http:/ 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：http:/【实验原理】如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某
2、一初始材料中纯化，富集某一含量较低的目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。另外，如果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。虽然多数情况下不需要将抗体与其他血清蛋白分开，但如果一旦需要，蛋白 A 亲和层析是一种非常有效的分离方法。蛋白 A 是从 Staphylococcus aureus 中获得，可与抗体重链的 Fc 片段相结合。现在已知蛋白 A 可与多种哺乳动物的 IgG 相结合也可与某些 IgM 和IgA 相结合。如果将蛋白 A 与固相载体相连，例如 sepharose CL-4B，这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要
3、工具。【实验材料】.实验仪器蛋白 A 柱（含 10ml 或 5ml 填料） ；泵；离心管；离心机；pH 试纸；过滤器；玻璃柱。.实验试剂 TBS 缓冲溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及 0.5g 叠氮化钠(0.05%)溶于 1L 蒸馏水中，并用 HCl 调节 pH 7.4。 中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及 5g 叠氮化钠(0.5%) 溶于 1L 蒸馏水中，并用 HCl 调节 pH8.0。 洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将 3.75g 甘氨酸(50
4、mM)溶解于 1L 蒸馏水中，用 HCl 调节pH 2.7。 洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将 3.75g 甘氨酸(50 mM)溶解于 1L 蒸馏水中，用 HCl 调节pH 1.9。 +2. 特异性结合目标蛋白 3. 分离已结合蛋白【实验方法】 准备蛋白 A sepharose CL-4B 亲和柱通常准备 5ml 或 10 ml 蛋白 A sepharose CL-4B 填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS 缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约 15 分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将蛋白 A sepharose CL-4B 填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速
5、度为 1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用 10 倍于床体积并经过预冷的 TBS 缓冲溶液平衡柱子。 制备抗血清将抗血清放入冰水或 4C 冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过 37C 预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为 0.05%，4C，15,000xg离心 5 分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。 亲和层析将抗体用 TBS 缓冲溶液以 1：5 的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟 0.5 ml 的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱 2 次并保留上样流出液。用 TBS 缓冲溶液清洗柱子至 A280nm0.00
6、8 后加 pH2.7 洗脱缓冲溶液，以 0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入 100ul 中和缓冲溶液的 1.5 ml EP 管分管收集洗脱液，混匀后用 pH 试纸检查洗脱液的 pH，如果 pH 低于 7 可利用中和缓冲液调至约pH7.4 以防止抗体的变性。在柱中加入 10ml,pH1.9 洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至 A280nm0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于 0.5mg/ml 可加入 10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在 2C8C 保存。用含 0.05%叠氮化钠的 TBS 缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在 2C8C 环境。【实验结果】利用 SDS/PAGE 检查洗脱获得的蛋白纯度并利用免疫电泳技术检查纯化后抗体的滴度。亲和层析的基本过程1. 配基与载体相连【注意事项】 叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作 在纯化过程中，预冷的 TBS 缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。
