1、本 科 毕 业 论 文 开 题 报 告MBR 系统中产高丝氨酸内酯的细菌的筛选及鉴定学 院： 林学院 专业年级： 水土保持与荒漠化防治 学 号： 姓 名： 指导教师、职称： 一、立题意义及国内外的研究现状与存在问题，主要研究内容及拟解决的关键性问题研究意义膜生物反应器（MBR）被认为是污水处理与回用的一种有效手段。然而在工程实践中，膜污染问题却一直影响着该技术的推广与应用。MBR 中膜的污染主要分为有机型、无机型及生物型三大类，其中生物型污染被认为是污水膜处理过程中的最重要问题之一 1。膜生物污染的本质是活性污泥中一些被截留的微生物通过与膜材料之间的相互作用而在其表面形成的生物膜 2。已有的研
2、究表明，从浮游状态到形成生物膜，微生物经历了从低密度到高密度、从无组织到有组织状态的过程，其中群体感应机制（quorum sensing，QS）在此过程中发挥着重要作用 3。群体感应是一种普遍存在于微生物细胞与细胞之间的依靠信号物质传导的信息交流机制，它使单细胞微生物之间能够在“群体水平”上“相互协作” ，完成一些单细胞无法进行的生物过程，包括形成生物膜 4-5。综上所述，既然膜生物污染是由相关微生物在膜表面形成生物膜的结果，而群体感应又恰好在微生物生物膜的形成过程中扮演着重要角色，那么从两者关联的角度考虑，MBR 体系内也应该存在着群体感应并发挥着重要作用。存在于细菌中的群体感应系统复杂多样
3、，因信号分子的不同而不同。从文献报道看，目前倍受关注且研究最为深入的是广泛存在于革兰氏阴性细菌的酰基化高丝氨酸内脂(Acyl-homoserine lactone, AHL)信号分子介导的群体感应系统。而且，此类信号分子及其生成菌株也在不同的生物膜环境中得到了分离，故研究此类信号分子所介导群体感应系统的调控作用具有重要的普遍意义和应用价值。综上所述，本研究以模拟生活污水为对象，考察 MBR 对其中污染物的去除能力，以及膜污染层的形成。并从 MBR 废水处理系统生物膜中分离出能够产生高丝氨酸内酯（AHL ）信号分子的细菌并对其进行鉴定，为生活污水 MBR 处理系统中细菌的群体感应可能参与调控的生
4、物膜形成等功能研究及 MBR 膜污染预防和控制提供理论依据。国内外研究现状及发展动态分析上世纪 70 年代，Nealson et al.6发现费氏弧菌（Vibrio fischeri）的生物发光与其菌体密度呈正相关，该发光现象受细菌本身的群体感应调节系统所控制。这是关于群体感应系统调节细菌生理功能的先驱报道，目前已成为研究革兰氏阴性细菌群体感应的模式系统。随着研究的深入，细菌的群体感应现象被证实广泛存在，并在许多细菌的重要活动中起着特定的调控作用。如根癌农杆菌Ti 质粒的转移 7、 、生物膜的形成 8、抗生素的合成 9、病原菌胞外酶与毒素产生 10、根瘤菌与植物共生 11等。我国从 20 世纪
5、 90 年代开始对膜生物反应器进行研究，通过十几年的精心研究与试验，现已取得了重大的成果。如郑宏林、朱家民 12等列举了 MBR 技术在污水资源化中推广应用的制约因素；罗虹，顾平，杨造燕 13测定了投加粉末活性炭对膜阻力的影响邢锴，张宏伟，龙树勇 14等对好氧颗特污泥在膜生物反应器中膜污染的特性进行了研究。不同种类的细菌往往利用不同结构的信号分子来调控群体感应系统基因的表达，从文献报道看，目前倍受关注且研究最为深入的是广泛存在于革兰氏阴性细菌的酰基化高丝氨酸内脂(Acyl-homoserine lactone, AHL)信号分子介导的群体感应系统。而且，此类信号分子及其生成菌株也被国内外学者在
6、不同的生物膜环境中得到了分离。McLean 等 15 证实了自然条件下形成的生物膜存在着 AHLs 类自诱导物。李蒙英等在硝基苯甲酸废水处理系统的生物膜中分离得到两株产生AHLs 类信号分子的菌株，并且这种菌株都存在一定的成膜能力。黄妙琴等 16 通过实验发现，在分离获得的 43 株海洋细菌中 AHLs 化合物活性菌株( 10 株) 90% 有很强的生物膜形成能力，并常能形成较大的细胞团。故研究 AHL 所介导的群体感应系统在生物膜形成中所起的调控作用，具有重要的普遍意义与应用价值。综合国内外的研究现状，虽然群体感应参与调节生物膜形成方面的研究日益广泛和深入，然而这些研究主要集中在致病菌（如铜
7、绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等）的生物膜，且研究重点在于探求群体感应信号传递的分子机制，以及寻找生物膜感染的药物靶点方面。迄今为止，对于环境污染物处理系统中的微生物群体感应现象则少有报道，尤其是对于实际运行中受膜生物污染限制较为严重的 MBR 污水处理系统，目前仅限于 Kim et al.和 Young al.的初步研究 17。Kim et al.则通过对 MBR 膜污染层内微生物的分离证实了反应器内除了 AHL 外，还存在着 AI-2 群体感应信号物质；Young et al.18通过将群体感应淬灭细菌（能够干扰 AHL 群体感应系统的细菌）封装到单穿空管中构成生物容器，并将其放入
8、 MBR 膜槽能维持微生物活性超过 100 天，有效地抑制了膜污染的发生。综上所述，MBR 污水处理系统中确实存在着群体感应现象，但目前对 MBR 膜生物污染的群体感应现象及功能却了解甚少，而揭示膜生物污染的机制、解决 MBR 的膜污染问题就必须要面对群体感应对膜生物污染的复杂的调控作用。因此，本项目立题开展 AHL 介导的群体感应系统调控 MBR 膜生物污染行为的研究，从而认识膜生物污染层中细菌群体感应的作用特征，深入理解 MBR 膜生物污染的形成机制。参考文献：1Liao BQ, Bagley DM, Kraemer G, et al. A review of biofouling and
9、 its control in membrance separation bioreactors J. Water Environ Res, 2004, 76(5):425-436.2Zhang L, Murphy PJ, Kerr A, Tate ME. Agrobacterium conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones J. Nature, 1993, 362:446-448.3Jayaraman A, Wood TK. Bacterial Quorum Sensing: Signals, Circui
10、ts, and Implications for Biofilms and Disease J. Annu. Rev. Biomed. Eng, 2008, 10: 145-67.4Ng WL, Bassler BL. Bacterial Quorum-Sensing Network Architectures J. Annu. Rev. Genet, 2009, 43:197-222.5Camilli A, Bassler BL. Bacterial Small-Molecule Signaling Pathways J. Science, 2006, 311:1113-1116.6Neal
11、son KH, Platt T, Hastings JW. Cellular control of the synthesis and activity of the bacteria luminescent system J. J Bacteriol, 1970, 104: 313-322.7Zhu J, Mekalanos JJ. Quorum sensing-dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholerae J. Dev Cell, 2003, 5:647-656.8Whistler CA, Pierson LS. Re
12、pression of phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens strain 30-84 by RpeA J. J Bacteriol, 2003, 185:3718-3725.9von Bodman SB, Bauer WD, Coplin DL. Quorum sensing in plant- pathogenic bacteria J. Annu Rev Phytopathol, 2003, 41:455-482.10Wisniewski-Dye F, Downie JA. Quorum-sensing i
13、n Rhizobium J. Antonie Van Leeuwenhoek, 2002, 81:397-407.11Teresa R De Kievit，Richard Gillis，Steve Marx，et alQuorum sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms:Their role and expression pattens Applied and EnvironmentalMicrobiology，2001 ，67( 4) : 1865-1873.12郑宏林，朱家民，黄金有，周勇，高从增 膜生物反应器在污水资源化中的研究与
14、应用探讨 水处理技术 V0135 No10 Oct ，2009 2113罗虹，顾平，杨造燕投加粉末活性炭对膜阻力的影响研究【J】 中国给水排水，2001，17(2) ： 1-414邢锴，张宏伟，龙树勇，等好氧颗特污泥膜生物反应器中膜污染特性的研究J中固给水排水，2009 25(5) ：323615李蒙英，陆鹏，张迹，等 生物膜中群体感应因子细菌的分离及成膜能力 中国环境科学，2007，27 ( 2) :194-19816黄妙琴，郭峰，柯才焕 近岸海洋细菌的群体感应与生物膜形成关系 厦门大学学报( 自然科学版) ，2010，49( 6) :863-87017Atkinson S, Chang C
15、-Y, Sockett RE, Cmara M, Williams P. Quorum Sensing in Yersinia enterocolitica Controls Swimming and Swarming Motility J. J Bacteriol, 2006, 188:1451-1461.18Kim S, Lee S, Hong S, Oh Y, Seoul M, Kweon J, Kim T. Biofouling of reverse osmosis membranes: Microbialquorum sensing and fouling propensity J.
16、 Desalination, 2009, 247:303-315.二、本课题的主要研究内容和方法、步骤、预期目的研究内容： （1 ） 模拟膜生物反应器(MBR)运行，测定膜生物反应器对生活污水的处理效果。（2 ） 从 MBR 系统中分离纯化细菌，并放于-80和 4下保存备用。（3 ） 筛选出产高丝氨酸内酯（AHL 信号因子）细菌并鉴定。研究目标：利用一体式 MBR 处理模拟生活污水，调查污水处理的效果与稳定性，分析运行过程中的膜污染情况。对反应器膜生物污染层中的优势微生物进行分离与筛选，通过分子生物学手段进行鉴定。利用紫色杆菌 CV026 ( Chromobacterium violaceum
17、 CV026)为报告菌，建立平板交叉换线法从膜生物反应器（MBR）模拟生活废水系统中分离、筛选出能够分泌群体感应信号因子高丝氨酸内酯（AHL）的细菌，对它们进行个体形态和 16S rDNA 序列进行分析，建立发育树确定菌株名。拟解决的关键问题：（1 ）实验室中模拟膜生物反应器(MBR)运行，并测定膜生物反应器对生活污水的处理效果。（2）膜生物反应器（MBR）模拟生活废水系统中分离、筛选出能够分泌群体感应信号因子高丝氨酸内酯（AHL）的细菌。（3）16RsDNA 片段扩增，结合其形态学特征和 16S rDNA 的测序结果，确定3.本项目的特色和创新之处及立论依据（与国内外类似研究比较）本项目的特
18、色：（1 ）群体感应对膜污染具有影响已被证实，但具体的影响方式及相关机制尚不清楚。（2）利用紫色杆菌 CV026 为报告菌，建立平板交叉换线法从膜生物反应器（MBR）模拟生活废水系统中分离、筛选出能够分泌群体感应信号因子高丝氨酸内酯（AHL）的细菌。立论依据：高丝氨酸内酯（AHL 信号分子）介导的群体感应系统是目前国内外倍受关注且研究最为深入的。而且，也有很多产生 AHL 的细菌从活性污泥中筛选出来 (Morgan-Sagastume et al., 2005)。Yeon et al.（2009）证明了 MBR 处理系统内存在着 G-菌特有群体感应信号 AHL，并发现随着污染层内 AHL 浓度
19、的升高，滤膜两端的跨膜压力也随之变大。不同信号因子及其调控基因也都有被研究，Vibrio fischeri 中 LuxRI/LuxR 基因调控 N-(3-oxohexanoyl)-HSL；Aeromonas hydrophila 中AhyI/AhyR 基因调控 N-butanoyl-HSL；Chromobacterium violaceum 中 CviI/CviR 基因调控 N-hexanoyl-HSL 等（Melissa et al.2001） 。国内外学者已成功采用构建微生物群体感应缺陷型模型对群体感应在不同生物学过程中的作用机制开展了研究，这为本课题提供了宝贵的理论和实践依据。4.研究工
20、作的预期结果或成果（1 ）通过模拟膜生物反应器(MBR)运行，测定膜生物反应器对生活污水的处理效果，并分离提纯出反应器中存在的细菌。（2 ）从分离出的细菌中筛选出能够分泌群体感应信号因子高丝氨酸内酯（AHL）的细菌，并加以鉴定。为以后研究群体感应对膜污染提供素材。三、研究工作总体安排及具体进度（1）2013 年 9 月-2013 年 10 月膜生物反应器在室温下运行，接种污泥取自福州祥坂污水处理厂。定期取反应器出水、反应器内上清液和污泥样品，测定 COD、氨氮、PH 值、污泥浓度等指标。（2）2013 年 10 月-2014 年 11 月反应器运行稳定后，进行生物膜上细菌的分离提纯，经纯化的菌株分别放于-80和 4下保存备用。以 Cviolaceum CV026 作为报告菌，利用平板交叉划线法筛选出产生产高丝氨酸内酯的细菌。（3）2013 年 11 月-2013 年 12 月对筛选出的产生产高丝氨酸内酯的细菌进行个体形态和 16S rDNA 序列进行分析，并初步鉴定菌株。 （3）2014 年 1 月-2014 年 5 月对实验内容进行总结，撰写研究论文，预备答辩。四、指导教师审查意见：签字： 年 月 日五、系(教研室)审查意见：签字： 年 月 日六、学院审查意见：分管院长签章： 年 月 日
