1、国家自然科技资源平台微生物菌种常规保藏技术规程（试行）自然科技资源收集、整理、保存技术规程研究与制定项目组二四年十二月十日2目 次前 言2引 言31 范围42 定义43 基本原则54 方法5附 录 A 定期移植保藏法6附 录 B 液体石蜡保藏法9附 录 C 沙土管保藏法11参考文献133前 言本规范由国家自然科技资源平台建设项目提出。本规范起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国食品发酵工业研究院、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所。本规范主要起草人：程池、李金霞、胡海蓉、姜瑞波、顾金刚、周
2、宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏等。4引 言微生物菌种常规保藏是一类重要的基本操作技术，广泛应用于科学研究、教学及生物技术产业，是保护微生物菌种资源的重要手段，是科研教学及生物技术产业正常运转的重要保障。本规程包括定期移植保藏法、液体石蜡保藏法和沙土管保藏法三种常用微生物菌种保藏方法。制定本规程是为了规范微生物菌种常规保藏技术操作，加强管理，以达到保护微生物菌种资源，利用微生物菌种资源及实现资源共享的目的。5微生物菌种常规保藏技术规程1范围本规程规定了微生物菌种常规保藏技术的基本原则和方法。本规程适用于微生物菌种的常规保藏工作。2定义本规程采用下列定义。2.1微生物菌种资源 microorga
3、nism resources指可培养的有一定科学意义、具有实际或潜在实用价值的古菌、细菌、真菌、病毒、细胞株等及其相关信息数据。2.2菌种保藏 culture preservation 是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。2.3定期移植保藏法 subculturing 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于46进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。2.4液体石蜡保藏法 preservation under liquid paraffin亦称矿物油保藏法,定
4、期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于415进行保存的一种菌种保藏方法。2.5沙土管保藏法 sand preservation亦称载体保藏法。是指将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子6吸附在载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于415进行保存的一种菌种保藏方法。3基本原则3.1 应针对菌种特性选择适宜方法进行保藏。3.3 应保证菌种保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和危害。4方法4.
5、1 定期移植保藏法见附录A。4.2 液体石蜡保藏法见附录B。4.3 沙土管保藏法见附录C。7定期移植保藏法A.1 适用范围本方法适用于大多数细菌和真菌。A.2 原理低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。A.3 技术要求A.3.1 不同菌种应根据要求选择合适的培养基。A.3.2 接种时要求无菌操作，避免染菌。A.3.3 保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取
6、出该管，重新移植培养后补上空缺。A.3.4 大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。A.3.5 每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。A.3.6 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。A.4 方法与步骤A.4.1 培养基制备A.4.1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。A.4.1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后
7、加足水量。8A.4.1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。A.4.1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。A.4.1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。A.4.1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。A.4.1.7 灭菌根
8、据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。A.4.1.8 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验。A.4.2 接种A.4.2.1 斜面接种A.4.2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2 中央划线从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。A.4.2.1.4 密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等
9、。A.4.2.1.5 挖块接种法挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。9A.4.2.2 穿刺接种用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.3 液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。A.4.3 培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。A.4.4 保藏A.4.4.1 保藏温度和时间培养好的菌种于 46保存，根据要求每 36 个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假
10、囊酵母，棉病囊霉等，须 13 个月移植一次。A.4.4.2 保藏湿度用相对湿度表示，通常为 50%70% 。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿度计。A.4.5 移植培养将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。A.4.6 菌种复壮菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。10附 录 B液体石蜡保藏法B.1 适用范围本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如芽孢杆菌属，醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属，曲霉属等)。B.2 原理液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌种的生物代谢受到抑制
11、，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。B.3 技术要求B.3.1 菌种培养参照附录A。B.3.2 应选用优质化学纯液体石蜡。B.3.3 液体石蜡易燃，在对液体石蜡保藏菌种进行操作时注意防止火灾。B.3.4 保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染。B.3.5 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。B.4 方法与步骤B.4.1 液体石蜡将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.1MPa灭菌30分钟取出，置40恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。B.4.2 斜面培养物的制备参照附录A，斜面宜短，不超过试管三分之一为宜。B.4.3 灌注石蜡 无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。B.4.4 保藏
